熊煜 ，高鑫，王瑾，孫欣，陳藝豐，潘岳陽，王麗萍

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科，沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院頭頸科，沈陽 110042）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中96%～98%為喉鱗狀細(xì)胞癌 （laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）［1］。根據(jù)國際癌癥研究署最新發(fā)布的GLOBOCAN 2018統(tǒng)計資料顯示，2018年全球約有17.7萬喉癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的1.0%［2］。國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國新增喉癌患者約2.64萬，喉癌死亡患者約1.45萬［3］。在我國，東北和華北地區(qū)喉癌發(fā)病率相對較高，尤其是東北地區(qū)，近年來發(fā)病率呈增高趨勢［4］。而喉癌患者總體預(yù)后仍不理想，其晚期生存率僅為44%［5］。因此，尋求新的喉癌相關(guān)治療靶點是早期預(yù)防、診斷和制定個體化治療策略的關(guān)鍵。Nin-one結(jié)合蛋白（Nin-one binding protein，NOB1） 是一種RNA結(jié)合蛋白，在核糖體合成、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和RNA代謝中有重要作用［6-9］。研究［10-15］表明，NOB1的異常表達(dá)往往會導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。本研究采用免疫組化SP法檢測LSCC中NOB1蛋白的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討其作為LSCC早期診斷和新的預(yù)后標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集和患者隨訪

收集2009年6月至2016年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科收治的226例LSCC患者的手術(shù)標(biāo)本。所有患者術(shù)后病理診斷均為LSCC，且病歷資料完整，術(shù)前均未經(jīng)過放化療。同時收集患者癌旁組織，將45例經(jīng)HE染色證實的正常黏膜作為對照。226例LSCC患者中，男159例，女67例，平均年齡（60.52±8.41） 歲 （42～79歲）；臨床分期:Ⅰ期27例，Ⅱ期66例，Ⅲ期71例，Ⅳ期62例；臨床分型:聲門上型107例，聲門型91例，聲門下型28例；組織分化程度:低分化26例，中分化104例，高分化96例。生存時間從手術(shù)日開始至隨訪日期或者截至由于喉癌復(fù)發(fā)及其他因素導(dǎo)致患者死亡的日期，按月計算。全部患者隨訪至2019年5月，隨訪時間18～118個月，中位隨訪時間59個月。

1.2 主要試劑

NOB1多克隆抗體 （工作濃度1 ∶200，英國Abcam公司）；SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

所有標(biāo)本均用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3.5 μm連續(xù)切片，于70 ℃烤片2 h后，常規(guī)脫蠟水化。置于pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)液中，熱修復(fù)10 min，冷卻至室溫，然后按SP試劑盒說明進(jìn)行實驗。于顯微鏡下DAB染色，蒸餾水終止反應(yīng)。后經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片。使用PBS溶液取代一抗作為陰性對照，排除非特異性染色。

圖1 NOB1在LSCC組織和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)情況 SP×200 Fig.1 Expression of NOB1 in LSCC and normal mucosa tissues SP×200

1.4 結(jié)果評估

采用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行評估，免疫組化染色陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)和 （或） 細(xì)胞核出現(xiàn)淡黃色或棕黃色、棕褐色。每張切片選擇5個有代表性高倍視野 （×200）。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和陽性細(xì)胞染色強度，用半定量免疫評分法來判定實驗結(jié)果。陽性細(xì)胞所占百分比:≤10%，0分；＞10%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。染色強度:不染色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。陽性細(xì)胞所占百分比與染色強度相加，0～3分為陰性，＞3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料應(yīng)用行×列聯(lián)表的χ2檢驗，采用Spearman秩相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Kaplan-Meier法統(tǒng)計患者生存率，采用log-rank法進(jìn)行生存率差異性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOB1蛋白在LSCC組織和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)

免疫組化染色 （圖1） 顯示，226例LSCC組織中NOB1主要在細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫性表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞核中也有表達(dá)，呈現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色，NOB1陽性表達(dá)142例，NOB1陽性表達(dá)率為62.8%；45例癌旁正常黏膜組織中NOB1陽性表達(dá)6例，NOB1陽性表達(dá)率為13.3%。LSCC組織中NOB1的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.094，P＜ 0.01）。

2.2 LSCC患者中NOB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者中NOB1陽性表達(dá)率為94.7%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者中NOB1陽性表達(dá)率為39.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=71.438，P＜ 0.05）。晚期 （Ⅲ～Ⅳ期） LSCC患者中NOB1陽性表達(dá)率為76.7%，而早期 （Ⅰ～Ⅱ期） LSCC患者中NOB1陽性表達(dá)率為43.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=26.585，P＜ 0.05）。NOB1蛋白表達(dá)與LSCC患者的年齡、性別、組織分化程度、腫瘤發(fā)生部位無關(guān) （P＞ 0.05）。見表1。

表1 NOB1蛋白表達(dá)與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationships between the expression of NOB1 and the clinicopathological characteristics of the LSCC patients ［n（%）］

2.3 NOB1蛋白表達(dá)與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系

226例LSCC患者中NOB1蛋白陽性表達(dá)142例，陰性表達(dá)84例。采用Kaplan-Meier法對LSCC患者進(jìn)行生存分析 （圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOB1陽性表達(dá)組5年生存率為54.4%，NOB1陰性表達(dá)組5年生存率為89.8%。采用log-rank法比較2組的生存率，結(jié)果顯示生存率有統(tǒng)計學(xué)差異 （χ2=31.277，P＜ 0.05）。

3 討論

圖2 NOB1陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Survival analysis of NOB1 positive and negative expression groups

NOB1是酵母基因Nob1p的人類同源體，是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，含有2個RNA結(jié)構(gòu)域 （N端的PIN結(jié)構(gòu)域和C端的鋅指結(jié)構(gòu)域）［6］，能促進(jìn)20S蛋白酶體成熟，參與26S蛋白酶體的形成與降解，相當(dāng)于26S蛋白酶體的亞基，對18S rRNA成熟起關(guān)鍵作用［7-8］，參與了核糖體40S小亞基的合成［7，9］。NOB1的異常表達(dá)影響蛋白酶體和核糖體的正常合成，造成體內(nèi)泛素-蛋白酶體途徑異常，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解異常。正常情況下，NOB1蛋白主要在人肺、脾臟和肝臟中表達(dá)，同時在食管、腎、結(jié)腸、肝、甲狀腺、卵巢等組織中有少量表達(dá)［10］。目前一些基礎(chǔ)研究表明，NOB1在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖中發(fā)揮重要作用［11］，其在胃癌［12］、骨肉瘤［13］、甲狀腺乳頭狀癌［14］、前列腺癌［15］、口腔鱗癌［16］等腫瘤組織中的表達(dá)均高于正常組織。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常喉黏膜相比，NOB1蛋白在LSCC組織中的表達(dá)明顯升高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。已有研究表明，在多種腫瘤組織中NOB1蛋白表達(dá)增加，這與本研究發(fā)現(xiàn)的NOB1蛋白在LSCC中表達(dá)增加的趨勢一致。本研究表明，NOB1的異常表達(dá)可能與喉癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程相關(guān)。本課題組前期研究［17］發(fā)現(xiàn)，沉默NOB1可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織標(biāo)本中NOB1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。以上研究表明，NOB1可能在LSCC的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要的作用。NOB1蛋白高表達(dá)提示喉癌預(yù)后不良，可作為潛在的評估喉癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。