林穎 王燕燕 于放

摘 要：長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）可以產(chǎn)生多種萜類吲哚生物堿，其中包括多種天然的抗癌藥物，但合成含量很低，茉莉酸信號(hào)通路可以調(diào)控這些萜類吲哚生物堿的生物合成，茉莉酸-異亮氨酸合成酶為茉莉酸信號(hào)通路中的關(guān)鍵元件。為了研究其功能，該文以長(zhǎng)春花葉片為材料，分析了CrJAR1基因所編碼的氨基酸序列，并進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果表明：CrJAR1基因編碼了585個(gè)氨基酸，該蛋白不存在跨膜區(qū)域，定位于細(xì)胞質(zhì)中，且該蛋白不含有信號(hào)肽;進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， 長(zhǎng)春花CrJAR1與筍瓜和番木瓜的JAR1同源性最高;對(duì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CrJAR1蛋白主要由α-螺旋構(gòu)成;同時(shí)，成功構(gòu)建了pET-30b-CrJAR1重組表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌BL21中異源表達(dá)，經(jīng)16、37 ℃分別誘導(dǎo)至16 h后，均顯示出最高的表達(dá)量。綜上結(jié)果，對(duì)長(zhǎng)春花中CrJAR1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并成功在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，這對(duì)體外該蛋白功能的研究具有深遠(yuǎn)影響，為調(diào)節(jié)茉莉酸信號(hào)通路甚至調(diào)控長(zhǎng)春花中次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成提供了指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)春花， 茉莉酸-異亮氨酸合成酶， 序列分析， 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)， 原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）08-1181-07

Abstract：Catharanthus roseus can produce a variety of terpeniod indole alkaloids， including a variety of natural anti-cancer， but the biosynthesis content is very low. The jasmonic acid signaling pathway regulates the biosynthesis of these terpeniod indole alkaloids. The jasmonic acid-isoleucine synthase is a key component in the jasmonic acid signaling pathway. In order to study its function， the amino acid sequence of CrJAR1 was analyzed， and prokaryotic expression was performed. Results had shown that the CrJAR1 gene encoded 585 amino acids， and the protein did not contain transmembrane structure. The subcellular localization analysis showed that the protein might be localized in the cytoplasm， and the protein did not contain signal peptide. Further phylogenetic tree analysis showed that the CrJAR1 had the highest homology with the JAR1 of the Cucurbita maxima and Carica papaya. The secondary and tertiary structures were predicted， and it was found that the CrJAR1 protein was mainly composed of α-helix. In addition， the recombinant expression plasmid pET-30b-CrJAR1 was constructed and successfully expressed in Escherichia coli BL21 after induction by IPTG. Induction at 16 and 37 ℃ after 16 hours， both showed the highest expression levels. In this paper， the bioinformatics analysis of CrJAR1 protein in Catharanthus roseus was successfully carried out and heterologously expressed in Escherichia coli. The study will have deep effect on research of CrJAR1 protein function in vitro， and provide instructive revelation for regulation of jasmonic acid signaling pathway， and even the regulation of the biosynthesis of secondary metabolites in Catharanthus roseus.

Key words： Catharanthus roseus， jasmonic acid-isoleucine synthase （JAR1）， sequence analysis， prediction of tertiary structure， prokaryotic expression

茉莉酸（jasmonic acid，JA）是一種植物激素，它在植物體內(nèi)廣泛存在，是植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。在植物中，茉莉酸類物質(zhì)可以作為調(diào)節(jié)信號(hào)，通過積累次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而調(diào)節(jié)植物的防御應(yīng)答反應(yīng)（杜紅梅等，2009）。茉莉酸及其衍生物能夠影響生物體內(nèi)多個(gè)基因的表達(dá)，從而影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累（Vom et al.， 2007）。當(dāng)植物受到外源脅迫或內(nèi)源影響時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)，這些信號(hào)可以促進(jìn)植物體內(nèi)JA的生成，JA從過氧化物酶體中生成，而后被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，由茉莉酸-異亮氨酸合成酶（JAR1）作用形成茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）。JA-Ile促進(jìn)泛素連接酶復(fù)合物（SCFCOI1）與茉莉素ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白（JAZ）形成復(fù)合物，當(dāng)形成復(fù)合物后，26S蛋白酶就會(huì)把JAZ蛋白水解掉。JAZ蛋白被水解后，之前被抑制活性的轉(zhuǎn)錄因子MYC2就會(huì)被釋放出來，可以和下游靶基因的 G-box相結(jié)合，從而影響下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響不同的次級(jí)代謝途徑，生成一系列次級(jí)代謝產(chǎn)物（Wasternack & Strnad，2015;Wasternack & Song，2016）。

長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）是夾竹桃科長(zhǎng)春花屬植物，其自身能夠產(chǎn)生超過130種萜類吲哚生物堿（terpeniod indole alkaloids，TIAs），其中包括目前應(yīng)用最廣泛的天然植物抗腫瘤藥物長(zhǎng)春堿（vinblastine）和長(zhǎng)春新堿（vincristine），它們可用于治療惡性淋巴腫瘤、急性白血病等疾病，此外，長(zhǎng)春花中的阿瑪堿（ajmalicine）可以起到降低血壓以及治療心臟等病癥（Li et al.， 2013），而蛇根堿（serpentine）能夠止疼。長(zhǎng)春質(zhì)堿（catharanthine）可以使血糖降低，并且還能夠消毒止血，同時(shí)還有利尿的功能，長(zhǎng)春質(zhì)堿還是合成長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿等生物堿的前體化合物（向蓓蓓等，2010）。但是由于這些萜類吲哚生物堿分布于長(zhǎng)春花的不同組織器官中（Rischer et al.， 2006），且含量很少，導(dǎo)致提取困難，且因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成難度非常大，因此許多研究者是通過利用基因工程的手段來提高TIAs的產(chǎn)量（楊致榮等，2005）。而在長(zhǎng)春花的茉莉酸信號(hào)通路中，螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）、AP2/ERFs和WRKY三個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子都參與調(diào)控了TIAs的生物合成，其中，CrMYC2是通過與AP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族中的ORCA2/3啟動(dòng)子上的 G-box 相似元件相結(jié)合，從而激活了轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了大多數(shù)TIAs的生物合成途徑（Zhang et al.， 2011）。

JAR1作為茉莉酸信號(hào)的重要元件，它能夠形成JA-Ile，在植物次生代謝調(diào)節(jié)方面具有非常重要的作用，但是目前對(duì)于長(zhǎng)春花中CrJAR1蛋白的研究還很少。本課題組在前期工作中成功地克隆了長(zhǎng)春花中的JAR1基因（徐巖等，2017），即CrJAR1，并且在長(zhǎng)春花葉片中過表達(dá)了CrJAR1，發(fā)現(xiàn)顯著提高了合成長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈途徑中相關(guān)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，并且促進(jìn)了文多靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿的積累。為了進(jìn)一步研究長(zhǎng)春花中CrJAR1蛋白在茉莉酸信號(hào)通路中的功能以及對(duì)下游TIAs的生物合成的影響，本研究將CrJAR1進(jìn)行原核細(xì)胞表達(dá)，初步確定了表達(dá)條件，并對(duì)該蛋白的氨基酸序列以及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。這為體外研究JAR1功能、深入研究茉莉酸信號(hào)通路調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

采取野生型長(zhǎng)春花葉片為材料。pET-30b載體和大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。TRNzol Reagent 試劑、RNase free DNase I、TIAN Script M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、pGM-T 載體、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;Prime STAR酶、ExTaq 酶、限制性核酸內(nèi)切酶（Kpn I、Sac I）、T4 DNA 連接酶購自 Takara 公司;瓊脂糖凝膠購自美國(guó) Promega 公司;其他試劑如乙醇、氯仿、異丙醇等均購自北京化工廠。

1.2 長(zhǎng)春花CrJAR1蛋白的氨基酸序列分析

長(zhǎng)春花CrJAR1基因的克隆在本實(shí)驗(yàn)室的前期已經(jīng)完成（徐巖等，2017）。通過 ExPASy Protemics Server提供的在線軟件 ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/）分析CrJAR1蛋白的氨基酸組成，并且預(yù)測(cè)CrJAR1基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，通過InterPro Scan （http：/ /www.ebi.ac.uk/ interpro/） 來分析蛋白質(zhì)的保守區(qū)域。分別使用 TargetP 1.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP 4.1 server（http：/ /www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP /）及TMHMM （http：/ /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 分析長(zhǎng)春花CrJAR1蛋白的亞細(xì)胞定位、是否含有信號(hào)肽以及跨膜區(qū)域，通過MEGA 5.1 軟件的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)CrJAR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/ interactive/RR9Bez/models/）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 pET-30b-CrJAR1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和Sac I對(duì)pGM-T- CrJAR1質(zhì)粒和pET-30b載體進(jìn)行雙酶切，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將酶切后的CrJAR1基因片段和pET-30b載體進(jìn)行膠回收，通過T4 DNA 連接酶連接，連接體系：10×T4 DNA Ligantion Buffer 1 μL，回收的pET-30b載體3 μL，酶切后的CrJAR1 5 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。在4 ℃連接24 h。將連接產(chǎn)物pET-30b-CrJAR1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-10Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中。將連接產(chǎn)物pET-30b-CrJAR1加入到大腸桿菌XL-10Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置5 min，42 ℃水浴30 s，冰上放置10 min，加入700 μL新鮮LB培養(yǎng)基，180 r·min-1 37 ℃震蕩1 h后，4 000 r·min-1離心3 min，涂布于平板上。挑取單菌落，并利用CrJAR1引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，確定陽性克隆，并將正確的樣品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)

將測(cè)序正確的陽性克隆接入50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃復(fù)蘇，并以2%的接入量接入200 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右時(shí)，加入IPTG，終濃度分別為0.4、1 mmol·L-1，分別在16、37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別收集不同時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物（0、2、4、8、16 h）。分別配制分離膠和濃縮膠，首先配制濃度為10% 的分離膠，再配制濃度為5%的濃縮膠，進(jìn)行電泳時(shí)，在濃縮膠部分，首先保持電壓為80 V，當(dāng)?shù)竭_(dá)分離膠以后，調(diào)整電壓，使電壓保持在120 V，當(dāng)樣品至分離膠底部時(shí)，關(guān)閉電源，將分離膠取出，用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，脫色后檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)春花CrJAR1氨基酸序列分析

長(zhǎng)春花CrJAR1基因編碼585個(gè)氨基酸（圖1），通過 ExPASy Protemics Server提供的在線軟件 ProtParam預(yù)測(cè)分析CrJAR1基因所編碼的蛋白質(zhì)的一些基本理化性質(zhì)，推測(cè)CrJAR1蛋白的分子量為65.95 kD，等電點(diǎn)pI為5.73，分子式為C2959H4614N772O880S27，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為65，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為75，脂肪指數(shù)為83.97，親水性為-0.254，不穩(wěn)定指數(shù)為40.02，這將CrJAR1蛋白歸類為不穩(wěn)定蛋白。通過使用InterPro Scan分析 CrJAR1蛋白，其結(jié)果顯示 CrJAR1蛋白含有保守結(jié)構(gòu)域，位于第19～560氨基酸處（茉莉酸酰胺合成酶，IPR031110），并且CrJAR1蛋白屬于GH3家族。

JAR1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，長(zhǎng)春花與筍瓜和番木瓜的JAR1蛋白的親緣關(guān)系比較近。SignalP 4.1 server預(yù)測(cè)結(jié)果表明CrJAR1蛋白不含有信號(hào)肽，且不存在跨膜區(qū)域。通過使用TargetP 1.1 Server分析長(zhǎng)春花CrJAR1蛋白的亞細(xì)胞定位，其中葉綠體的定位系數(shù)為0.124，線粒體的定位系數(shù)為0.086，其他位置為0.912，因此該蛋白可能位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步利用SOPMA預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)α-螺旋占41.88%，不規(guī)則卷曲占38.8%，表明它們構(gòu)成了蛋白的主要結(jié)構(gòu)，其次還包括部分延伸鏈（14.36%）和少部分β-轉(zhuǎn)角（4.96%）分散在蛋白質(zhì)中。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)CrJAR1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖3所示，以CrJAR1蛋白的同源模型5ech.2.A，在第10～584位氨基酸建模，其模型覆蓋率為 64.51%。

2.2 原核表達(dá)載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過Kpn I和Sac I對(duì)測(cè)序正確的pGM-T- CrJAR1質(zhì)粒和pET-30b載體進(jìn)行雙酶切，分別回收載體片段和CrJAR1片段，通過T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建pET-30b-CrJAR1原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-10Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆菌落，經(jīng)過PCR驗(yàn)證后，在1 700 bp左右存在明顯條帶。提取質(zhì)粒后，用Kpn I和Sac I進(jìn)行雙酶切，其結(jié)果如圖4所示，結(jié)果正確。將該菌液送至北京華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與前期克隆CrJAR1基因的結(jié)果一致，證明pET-30b-CrJAR1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的原核表達(dá)與SDS-PAGE 分析

將pET-30b-CrJAR1轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)宿主中，復(fù)蘇后擴(kuò)大培養(yǎng)至200 mL LB培養(yǎng)基中，待OD600為0.6左右時(shí)，取出2 mL菌液作為0 h樣品，然后分別加入終濃度0.4、1 mmol·L-1 IPTG在16、37 ℃誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)，并且在2、4、8、16 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集菌液。通過SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。如圖5所示，在70和50 kD 之間有明顯條帶，與CrJAR1蛋白的分子量65.95 kD相近，并且在16、37 ℃兩種溫度誘導(dǎo)條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，條帶明顯加深，表明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，CrJAR1蛋白的表達(dá)量越來越多。上述研究為后續(xù)純化以及體外研究提供一定依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

茉莉酸-異亮氨酸合成酶 （JAR1）的功能在許多植物中都有所報(bào)道，其作為茉莉酸信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶，在調(diào)控茉莉酸信號(hào)方面起著十分重要的作用（Chen et al.， 2018）。在茉莉酸信號(hào)通路中，茉莉酸通過腺苷化與異亮氨酸共價(jià)結(jié)合形成茉莉酸-異亮氨酸，從而開啟下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其JAR1關(guān)鍵酶的作用機(jī)理分為以下三個(gè)部分：腺苷化;共價(jià)結(jié)合;抗性基因表達(dá)的誘導(dǎo)（Shen et al.， 2016）。長(zhǎng)春花作為一種天然的抗癌抗腫瘤藥物，其本身含有多種萜類吲哚生物堿，但由于這些生物堿在長(zhǎng)春花中的合成含量甚少（Pandey et al.， 2016），其合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于需求量，所以近年來對(duì)于萜類吲哚生物堿的合成途徑的研究越來越多（Caputi et al.， 2018）。其中，針對(duì)茉莉酸信號(hào)調(diào)節(jié)長(zhǎng)春花中萜類吲哚生物堿的合成的相關(guān)研究還很少。在使用外源激素處理植物時(shí)，適宜的濃度和處理時(shí)間可以使產(chǎn)物大量合成，但濃度過高或處理時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)使產(chǎn)量下降（乞永艷等，2006），并且大量使用外源激素成本較高，且易造成環(huán)境污染。但通過基因工程的手段來影響相關(guān)基因的表達(dá)，則可以避免這些問題，并且可以提高長(zhǎng)春花中次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此，成功克隆并且了解合成JA-Ile途徑中的關(guān)鍵酶基因，對(duì)于目前的生產(chǎn)和研究來說是十分重要的。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)可以通過對(duì)茉莉酸信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)放大來增加長(zhǎng)春花中萜類吲哚生物堿的生物合成（徐巖等，2017），但對(duì)于CrJAR1蛋白的功能研究尚不完全。本研究克隆了長(zhǎng)春花中的CrJAR1基因，并確定該基因編碼585個(gè)氨基酸，并且對(duì)長(zhǎng)春花CrJAR1蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。經(jīng)過亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)出該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，表明CrJAR1蛋白是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能的（Wasternack & Strnad，2015;Wasternack & Song，2016）。經(jīng)過對(duì)CrJAR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有茉莉酸酰胺合成酶保守的結(jié)構(gòu)域，屬于GH3家族成員，并且通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春花CrJAR1蛋白與筍瓜和番木瓜的JAR1蛋白的親緣關(guān)系比較近，表明CrJAR1蛋白可能是在長(zhǎng)春花的茉莉酸信號(hào)途徑中合成JA-Ile的關(guān)鍵酶。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30b-CrJAR1，并且成功在大腸桿菌BL21中異源表達(dá)CrJAR1蛋白。通過不同濃度IPTG在不同溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，CrJAR1蛋白表達(dá)量最高。此外，該酶體外功能驗(yàn)證也在進(jìn)行。盡管如此，現(xiàn)階段的研究仍有助于我們深入研究長(zhǎng)春花中茉莉酸生物合成途徑以及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，并為研究長(zhǎng)春花中次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成提供依據(jù)。

目前對(duì)于長(zhǎng)春花中次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究主要集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑上，但仍然有很多方面的因素可以影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成，如內(nèi)源外源的刺激以及多種植物激素如茉莉酸、水楊酸等的調(diào)控（Goldhaber et al.， 2014）等，因此，我們將繼續(xù)對(duì)長(zhǎng)春花中茉莉酸-異亮氨酸合成酶的功能以及茉莉酸信號(hào)通路中其他重要的信號(hào)調(diào)節(jié)因子進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討它們對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響，為后續(xù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

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