雷 可，雷 濤，朱 萌，邱 容，王 倩，梁卓文

周圍神經(jīng)損傷后雖然具有一定的再生能力，但是再生能力有限，在大部分再生神經(jīng)重新到達(dá)并支配靶組織之前，遠(yuǎn)端靶組織就已發(fā)生萎縮[1-2]。 因此，如何加快神經(jīng)軸突生長及功能恢復(fù)是困擾人們的難題。 嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，OECs)是一種特殊的嗅神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞[3]，大量的研究表明，OECs 能夠促進(jìn)中樞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生[4-6]。 然而，細(xì)胞移植至神經(jīng)損傷區(qū)域?qū)⒚媾R缺氧微環(huán)境，進(jìn)一步影響移植細(xì)胞活性，嚴(yán)重制約細(xì)胞移植的神經(jīng)修復(fù)效果[7]。 因此，改善OECs 移植區(qū)域的局部微環(huán)境供氧非常必要。組織工程材料的發(fā)展，為解決這一問題帶來了希望。 全氟碳化物(perfluorocarbons，PFCs)，如全氟三丁胺(perfluorotributylamine，PFTBA)能夠高效提升組織材料中的氧含量，作為血液替代品廣泛應(yīng)用[8-9]。 多項(xiàng)研究表明，在低氧條件下，PFTBA 能提高不同類型的細(xì)胞活性及存活率[7，10]。 因此，PFTBA 成為一種有吸引力的補(bǔ)充材料，能夠?yàn)橐浦苍趽p傷區(qū)域的OECs 提供持續(xù)氧供，打破其缺氧微環(huán)境。 本研究將PFTBA 作為材料與Matrigel 混合為攜氧材料與OECs 混合后植入聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)靜電紡絲神經(jīng)導(dǎo)管。 在體內(nèi)條件下測試該復(fù)合物神經(jīng)導(dǎo)管對大鼠坐骨神經(jīng)1 cm 缺損的修復(fù)效果，為其在周圍神經(jīng)再生領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 選取6 ～8 周齡雄性SD 大鼠，10 只用于提取OECs，96 只用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 所有大鼠均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，本實(shí)驗(yàn)已通過空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)(KY20172005-1)。DF12(DMEM 和Ham′s F12 的1 ∶1混合物)細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素(美國Gibco 公司)；胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液、Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司)；左旋多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)、聚ε-己內(nèi)酯(ε-caprolactone，PCL)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美國Sigma-Aldrich 公司)；多聚甲醛(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；進(jìn)口山羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；SMA 單克隆抗體、p75NTR單克隆抗體、NF160 單克隆抗體(英國Abcam 公司)；山羊抗鼠Cy3、山羊抗兔FITC、山羊抗鼠FITC(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶(廣州潔特生物過濾股份有限公司)；石蠟切片機(jī)(德國LEICA 公司)；共聚焦顯微鏡(日本Nikon 公司)；透射顯微鏡(日本Hitachi 公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 SD 大鼠60 只，隨機(jī)分為3組:自體神經(jīng)移植組，PFTBA-OECs 神經(jīng)導(dǎo)管組(PFTBAOECs組)；OECs 神經(jīng)導(dǎo)管組(OECs組)，每組20 只。

1.2.2 OECs 的提取以及純化 依照Goulart 等[11]總結(jié)的方法并加以少許改動，分離6 ～8 周齡的雄性SD 大鼠嗅球，并從中剝?nèi)⌒嵘窠?jīng)層及嗅粘膜。0.25%胰蛋白酶消化20 min。 終止消化，1000 r/min 離心5 min，使用含有10%胎牛血清的DF12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種；36 h 后，取未貼壁的細(xì)胞懸液，接種至PLL 包被的培養(yǎng)瓶中，正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，貼壁細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 OECs 鑒定 純化后的OECs，固定后進(jìn)行免疫熒光染色，對SMA 和p75NTR進(jìn)行特異性免疫熒光標(biāo)記。 拍攝選取隨機(jī)區(qū)域并計(jì)數(shù)SMA 和p75NTR均陽性細(xì)胞數(shù)量及DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核數(shù)量，兩者之比計(jì)算OECs 純度。

1.2.4 移植后細(xì)胞活性測試 使用慢病毒轉(zhuǎn)染OECs 細(xì)胞[12]，使其表達(dá)綠色熒光蛋白，即GFP-OECs。術(shù)后3，7，14，28 d，將各組大鼠(每個時間點(diǎn)，每組大鼠9 只)神經(jīng)移植物，縱斷面冰凍切片，在熒光顯微鏡下對GFP-OECs 進(jìn)行計(jì)數(shù)。 每個切片隨機(jī)選取5 個視野(1000 μm×300 μm)用于分析。

1.2.5 坐骨神經(jīng)再生評估 取各組大鼠坐骨神經(jīng)移植物石蠟切片。 對切片進(jìn)行免疫熒光染色，特異性標(biāo)記NF200 和S100。 通過共聚焦顯微鏡收集免疫熒光染色結(jié)果。

1.2.6 再生神經(jīng)軸突髓鞘化評估 將各組神經(jīng)移植物處理后超薄切片，透射電鏡觀察并計(jì)算再生軸突的髓鞘厚度。

1.2.7 功能恢復(fù)評估 計(jì)算坐骨神經(jīng)指數(shù)(sciatic function index，SFI)評估坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)，術(shù)后4、8 周，分別收集各組大鼠5 只可進(jìn)行足跡測量。 用以計(jì)算SFI 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率表示，行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 自體神經(jīng)移植組，OECs

神經(jīng)導(dǎo)管組，PFTBA-OECs 神經(jīng)導(dǎo)管組大鼠均存活，全部進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2.2 OECs 純度 OECs 經(jīng)過純化后進(jìn)行p75NTR和SMA 雙標(biāo)免疫熒光染色(圖1)。 OECs 純度(%)＝p75NTR和SMA 雙標(biāo)染色均陽性細(xì)胞數(shù)量及DAPI 標(biāo)記的同一視野細(xì)胞核數(shù)量。 本研究所測得的OECs純度為(95.8±2.1)%。

圖1 OECs 免疫熒光染色鑒定

2.3 PFTBA 對移植OECs 成活率的影響 術(shù)后3、7、14、28 d 分別對GFP-OECs 計(jì)數(shù)。 PFTBA-OECs組GFP-OECs 數(shù)量在術(shù)后每個統(tǒng)計(jì)時間點(diǎn)均明顯多于OECs組(P＜0.05)，圖2。

圖2 PFTBA 在體內(nèi)條件下對OECs 存活率的影響

2.4 PFTBA-OECs 對神經(jīng)再生的影響 術(shù)后4 周免疫熒光染色結(jié)果顯示，自體神經(jīng)組和PFTBAOECs組再生神經(jīng)纖維在損傷遠(yuǎn)端也有分布，雪旺細(xì)胞數(shù)量也明顯多于OECs組(P＜0.05)，圖3。

2.5 PFTBA-OECs 對再生軸突髓鞘化的影響 術(shù)后4 周再生神經(jīng)組織的透射電鏡結(jié)果顯示，PFTBAOECs組再生神經(jīng)軸突的數(shù)量明顯多于OECs組(P＜0.05)，與自體神經(jīng)移植組接近；PFTBA-OECs組髓鞘厚度明顯優(yōu)于OECs組(P＜0.05)，圖4。

2.6 PFTBA-OECs 對坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的影響 術(shù)后2、4、8 周SFI 顯示PFTBA-OECs組SFI值與自體神經(jīng)移植組接近(P＞0.05)，明顯優(yōu)于OECs組(P＜0.05)，圖5。

圖3 PFTBA-OECs 對大鼠坐骨神經(jīng)再生的影響

圖5 術(shù)后2、4、8 周大鼠SFI 值統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

OECs 能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)的再生以及生長[13-15]。 盡管OECs 移植能夠在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)的再生以及功能的恢復(fù)，但是移植后，局部微環(huán)境的惡化[16]，如缺氧、炎性反應(yīng)等，致使移植細(xì)胞存活率低、生物活性差，嚴(yán)重制約了OECs促神經(jīng)修復(fù)作用的發(fā)揮[7]。 因此，為移植細(xì)胞設(shè)計(jì)持續(xù)的供氧方案對于提高神經(jīng)修復(fù)非常必要。

大量研究表明PFTBA 能夠提高多種細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞活性。 因此，PFTBA 為組織工程修復(fù)神經(jīng)缺損的局部缺氧提供了解決方法。 本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合有PFTBA 的OECs 在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)存活率顯著提高。 在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型中發(fā)現(xiàn)PFTBA 能夠有效打破移植局部缺氧微環(huán)境，顯著促進(jìn)再生軸突的生長，為再生神經(jīng)軸突營造良好的再生微環(huán)境。

本研究還發(fā)現(xiàn)PFTBA-OECs 能夠提升再生神經(jīng)軸突的髓鞘化程度。 各處理組大鼠SFI 值表明，PFTBA-OECs 處理組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于OECs 處理組。 本研究的缺點(diǎn)是尚未就PFTBA對細(xì)胞活性影響促進(jìn)神經(jīng)再生的具體機(jī)制進(jìn)一步探究。 下步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步深入了解PFTBA 促進(jìn)神經(jīng)再生的具體分子機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了PFTBA 在OECs 移植以及組織工程方法修復(fù)神經(jīng)缺損過程中的有效性，為解決組織修復(fù)材料局部缺氧提供了解決方案，為進(jìn)一步提高組織工程方法修復(fù)神經(jīng)損傷療效提供了新視野。