王媛媛，王繼巖，焉 莉，高 強

(吉林省商品糧基地土壤資源可持續(xù)利用重點實驗室/ 吉林農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，吉林 長春 130118)

吉林省地處松遼平原，屬溫帶大陸性季風氣候區(qū)，地勢呈明顯的東南高、西北低特征，四季分明，自然生態(tài)環(huán)境良好，是我國重要的黑土保護區(qū)。2018年吉林省玉米播種面積為423萬hm2，占全省農(nóng)作物總播種面積的69.6%，占全國玉米總播種面積的10.3%，是吉林省第一大糧食作物。根據(jù)氣候條件、環(huán)境因子和地形地貌等方面的差異，將吉林省分為3個生態(tài)區(qū)，即東部濕潤山區(qū)、中部半濕潤平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)[1-2]。3個生態(tài)區(qū)的積溫和總?cè)照諘r數(shù)自東向西逐漸增加，而總降水量則逐漸降低。有研究證明，吉林省玉米產(chǎn)量為中部>東部>西部[3]；氮肥利用率則呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢[4]；鉀肥利用率表現(xiàn)為西部>東部>中部[5]；速效磷含量則自東向西逐漸下降[6]。可見吉林省玉米產(chǎn)量和肥料利用率存在顯著的區(qū)域差異。前人的研究多集中于小尺度的田塊作物產(chǎn)量、肥料利用率與土壤微生物的關(guān)系，但從生物地理學的角度來發(fā)掘和探索基于區(qū)域尺度的氣候因素、土壤肥力特征與土壤微生物結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究相對較少。

土壤微生物對外界環(huán)境的細微變化非常敏感，細菌、真菌和放線菌是其重要組成部分，在降解有機質(zhì)和促進營養(yǎng)循環(huán)等方面起積極作用[7]，且共同維系著生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定[8]。其中，細菌是土壤微生物中含量最多、豐富度最高的類群[9]，環(huán)境因子的變化諸如地理因素、積溫、氣候變化、降雨量、理化性質(zhì)、酶活性的差異性將引起土壤細菌群落種類和多樣性的改變[10]，從而直接影響土壤中養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)[11]。有研究證明，土壤pH值是影響細菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因子[12]。LIU等[13]對細菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明，細菌的群落結(jié)構(gòu)組成和豐富度除了受pH值影響外，還與土壤有機質(zhì)密切相關(guān)。王楠楠等[14-15]研究證實了降水量的變化能夠明顯驅(qū)動土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成變化，不同降水條件下細菌的優(yōu)勢種群和豐度差異顯著。CONG等[16]研究證明了土壤溫度是影響微生物群落分布的主要因素，溫度升高增強了土壤微生物的代謝活性，從而影響土壤微生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)和組成[17]。不同地區(qū)的氣候條件差異可能導致環(huán)境因子對土壤微生物的影響程度不同，因此有必要分析何種環(huán)境因子對當?shù)氐耐寥牢⑸锶郝涮卣饔兄匾绊憽?/p>

該研究以吉林省玉米種植土壤為研究對象，通過測定不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的化學性質(zhì)、酶活性及細菌微生物群落結(jié)構(gòu)特征，分析環(huán)境因子對當?shù)赝寥兰毦⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)的影響，系統(tǒng)研究氣候、土壤化學性質(zhì)、生物性質(zhì)對土壤細菌的影響機制，分析土壤環(huán)境因子與土壤微生物之間的聯(lián)系，尋找影響土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性的主要驅(qū)動因子，對改進吉林省玉米種植土壤的管理策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)介紹

土壤采樣點分布于吉林省3個不同生態(tài)區(qū)，其氣候特點見表1。東部濕潤山區(qū)的年均溫為4.20 ℃，年均降雨量為590～910 mm，有效積溫為2 569.3 ℃，無霜期為115～170 d。采樣位置主要包括延邊的敦化和汪清、白山的江源和靖宇、吉林的樺甸和蛟河以及通化的輝南。暗棕壤和白漿土是東部生態(tài)區(qū)的主要土壤類型。

表1 吉林省不同生態(tài)區(qū)氣候條件及土壤理化性質(zhì)

中部半濕潤平原區(qū)的年均溫為5.4 ℃，年均降雨量為450～710 mm，有效積溫為2 831.4 ℃，無霜期為125～160 d。采樣位置主要包括吉林的磐石、舒蘭和永吉，四平的公主嶺、梨樹、雙遼、伊通，遼源的東遼和東豐，通化的梅河，長春的德惠、榆樹和雙陽。黑鈣土、白漿土和黑土是中部生態(tài)區(qū)的主要土壤類型。

西部半干旱平原區(qū)的年均溫為4.8 ℃，年均降雨量為378～494 mm，有效積溫為2 940.2 ℃，無霜期為135～157 d。采樣位置主要包括白城的大安、洮南、通榆、鎮(zhèn)賚和松原的前郭、扶余、長嶺。黑鈣土、草甸土和風沙土是西部生態(tài)區(qū)的主要土壤類型。

1.2 土壤樣品采集

于2018年6—7月對吉林省東部濕潤山區(qū)、中部半濕潤平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)3個生態(tài)區(qū)的玉米種植土壤樣品進行采集，采樣深度為0～20 cm，采用五點采樣法共采集了72份土壤樣品，每種土壤樣品重復(fù)采集3次，結(jié)果取其3次重復(fù)的平均值，以確保實驗的精確度。所有樣品采集后立即過2 mm孔徑篩，然后分成3份，1份于-80 ℃條件下保存用于高通量測序，1份存放在4 ℃冰箱用以測定土壤酶活性，1份土壤風干保存用以測定土壤理化性質(zhì)。

1.3 理化性質(zhì)、酶活性的測定與土壤測序

1.3.1理化性質(zhì)測定方法

采用風干土壤樣品進行理化性質(zhì)分析，測定方法參照文獻[18]。pH值采用電位法測定，水土質(zhì)量比為2.5∶1；土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定；堿解氮含量采用堿解擴散法測定；速效磷含量采用鉬銻抗比色法 ( 0.5 mol·L-1碳酸氫鈉浸提)測定；速效鉀含量采用火焰光度計法(醋酸銨浸提)測定。

1.3.2酶活性測定方法

脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定[19],以24 h后1 g土壤中NH3-N含量表示。蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[20]274-276,以24 h后1 g干土生成的葡萄糖量表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法(酸性磷酸酶用醋酸鹽緩沖液，中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液，堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液)測定[20]312-313,以24 h后1 g土壤中釋放出的酚含量表示。每個樣品均做無基質(zhì)對照和無土對照，所有樣品均做3次重復(fù)，以保證數(shù)據(jù)的準確度。

1.3.3土壤細菌16sDNA Amplicon高通量測序分析

使用土壤試劑盒(美國Omega)，從0.5 g土壤中提取土壤總DNA，選用細菌16S rRNA基因的高度可變的V3-V4區(qū)用來測序，PCR擴增選用細菌16S rDNA V3-V4 區(qū)特異性引物，338F(5′-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25～27個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增結(jié)果進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取目標片段，用Axygen回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并純化。最后，對合格的文庫用Illumina技術(shù)進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用QIIME軟件中的OTU表計算操作分類單元中的Chao1指數(shù)。使用R軟件繪制維恩圖和典范對應(yīng)分析(CCA)圖，分析樣品中共有和獨有OTU的數(shù)量關(guān)系以及環(huán)境因子對細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性的影響。利用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進行吉林省不同生態(tài)區(qū)土壤細菌豐度數(shù)據(jù)的單因素分析(ANOVA)，用Duncan法分析不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的細菌差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的理化性質(zhì)

由表1可知，目前吉林省玉米種植土壤的pH平均值為6.58，有機質(zhì)含量平均值為13.11 g·kg-1，堿解氮含量平均值為111.93 mg·kg-1，速效磷含量平均值為35.42 mg·kg-1，速效鉀含量平均值為128.08 mg·kg-1。不同生態(tài)區(qū)的土壤理化性質(zhì)差異明顯。其中西部半干旱平原區(qū)的pH值較高，土壤偏堿性；中部半濕潤平原區(qū)土壤呈中性；東部濕潤山區(qū)pH值偏低，土壤呈酸性。東部濕潤山區(qū)的土壤有機質(zhì)含量最高，中部半濕潤區(qū)次之，西部半干旱平原區(qū)土壤有機質(zhì)含量最低。東部濕潤山區(qū)土壤堿解氮和速效鉀含量較高，中部半濕潤平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)則較低，但2個區(qū)域無顯著差異。綜上所述，東部濕潤山區(qū)的土壤肥力較高，中部半濕潤平原區(qū)次之，西部半干旱平原區(qū)的土壤肥力較低。參考已有研究可知，中部地區(qū)的玉米產(chǎn)量較高，東部地區(qū)次之，西部產(chǎn)量最少[4-5]。這是土壤肥力和氣候、地形地勢等多因素綜合作用的結(jié)果。

2.2 吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的酶活性特征

由表2可知，玉米種植土壤的脲酶活性均值為36.58 mg·g-1·d-1，蔗糖酶活性均值為120.69 mg·g-1·d-1，堿性磷酸酶活性均值為0.88 mg·g-1·d-1，中性磷酸酶活性均值為2.68 mg·g-1·d-1，酸性磷酸酶活性均值為1.76 mg·g-1·d-1。脲酶和蔗糖酶均為土壤中重要的水解酶，可直接或間接反映土壤生物學活性強度。中部半濕潤平原區(qū)的脲酶活性顯著低于東部和西部地區(qū)(P<0.05)，而東部濕潤山區(qū)的蔗糖酶活性顯著低于中部和西部地區(qū)(P<0.05)。東部濕潤山區(qū)的酸性磷酸酶活性在3個生態(tài)區(qū)中最高，西部半干旱平原區(qū)的堿性磷酸酶活性顯著高于其他2個生態(tài)區(qū)(P<0.05)。通過以上分析可知，偏酸性土壤的酸性磷酸酶活性較高，偏堿性土壤的堿性磷酸酶活性較高。

2.3 吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤細菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

由表1可知，中部半濕潤平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)的Chao1指數(shù)平均值顯著高于東部濕潤山區(qū)，說明其具有較高的細菌菌群豐度。西部半干旱平原區(qū)的Chao1指數(shù)變異系數(shù)最小，說明西部半干旱平原區(qū)的樣本相對中部和東部生態(tài)區(qū)來說更為均勻。

表2 吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米土壤的酶活性

2.4 吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)組成

對所有樣品進行16S rRNA測序，得到的細菌分類OTU共12 412個。其中，中部半濕潤平原區(qū)細菌OTU數(shù)最多，共10 096個；其次是西部半干旱平原區(qū)，細菌OTU數(shù)為7 854個；而東部濕潤山區(qū)細菌OTU數(shù)為6 585個。3個生態(tài)區(qū)共同包含的細菌OTU數(shù)有3 370個，占各個生態(tài)區(qū)的比例為33.38%～51.18%。各個生態(tài)區(qū)獨有的細菌OTU數(shù)目及占比分別為中部1 514(18.05%)、東部1 418(11.04%)和西部727(15.00%)。這表明不同生態(tài)區(qū)間的細菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，其中中部和西部群落共有OTU數(shù)較高，細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似；西部和東部群落共有OTU數(shù)相對較少，細菌群落結(jié)構(gòu)存在部分差異。

土壤細菌在門、屬分類水平上的相對豐度如圖1所示。將3個生態(tài)區(qū)所有樣品進行整體分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上放線菌門(Actinobacteria，占比19.14%～45.64%)為相對豐度最高的優(yōu)勢菌門，其次是變形菌門(Proteobacteria，21.65%～35.22%)、綠彎菌門(Chloroflexi，11.56%～17.67%)、酸桿菌門(Acidobacteria，5.91%～14.66%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，5.43%～10.49%)。從3個生態(tài)區(qū)分布看，放線菌門呈現(xiàn)自西向東逐漸減少的趨勢，而變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度與之相反，呈現(xiàn)自東向西逐漸減少的趨勢，西部半干旱平原區(qū)的綠彎菌門含量最高，中部半濕潤平原區(qū)的芽單胞菌門含量最高。

屬水平上真菌豐度較高的有芽單胞菌屬(Gemmatimonas，1.35%～3.93%)、紅色桿菌屬(Rubrobacter，0.55%～4.86%)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas，1.32%～2.38%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium，1.28%～2.49%)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum，0.05%～6.98%)。吉林省3個生態(tài)區(qū)玉米種植土壤細菌群落中，芽單胞菌屬在中部半濕潤平原區(qū)占比最高，其次是東部半濕潤山區(qū)和西部半干旱平原區(qū)，蒼白桿菌屬、慢生根瘤菌屬呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢。排名前20的細菌菌屬一致，但含量有細微差別。

圖1 吉林省各生態(tài)區(qū)細菌門及屬水平的相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacterial at phylum and genus levels in various ecological regions of Jilin Province

2.5 土壤細菌群落與環(huán)境因子的CCA分析

該研究采用CCA分析法探究影響吉林省各生態(tài)區(qū)細菌群落組成的環(huán)境因子，更加直觀、清晰地體現(xiàn)出土壤理化特性及氣候因素對土壤細菌群落多樣性及優(yōu)勢類群的影響。如圖2所示，環(huán)境因子中pH值的射線最長，其次為射線堿解氮和有機質(zhì)含量，因此，pH值、堿解氮含量、有機質(zhì)含量對細菌微生物群落結(jié)構(gòu)影響程度最高，是土壤細菌優(yōu)勢類群變化的主要驅(qū)動因子；其次是降雨量和緯度，可見氣候因子中降雨量和緯度對細菌群落結(jié)構(gòu)影響也較大。酸性磷酸酶活性、年均降雨量、中性磷酸酶夾角為銳角；pH值、積溫、脲酶活性、堿性磷酸酶活性、蔗糖酶活性之間夾角均為銳角，表明這幾種環(huán)境因子之間存在正相關(guān)關(guān)系，且可能具有一定的協(xié)同效應(yīng)。從吉林省不同生態(tài)區(qū)細菌分布來看，大部分西部半干旱平原區(qū)的土壤樣品分布在CCA橫坐標軸的負方向，東部濕潤山區(qū)的土壤樣品分布在CCA橫坐標軸的正方向；而中部半濕潤平原區(qū)的土壤樣品分布主要集中在坐標軸附近。西部和東部生態(tài)區(qū)樣本分布距離相對較遠，說明2個生態(tài)區(qū)中的土壤微生物細菌群落結(jié)構(gòu)有各自獨特的特點。

樣品編號首字母W代表西部地區(qū)；首字母C代表中部地區(qū)； 首字母E代表東部地區(qū)樣品。圖2 細菌群落與環(huán)境因子的典范對應(yīng)分析Fig.2 CCA analysis of bacterial community and environmental factors

通過R軟件利用偏最小二乘回歸分析，對物種豐度矩陣和樣本分組數(shù)據(jù)構(gòu)建PLS-DA判別模型(圖3)，也能發(fā)現(xiàn)吉林省3個生態(tài)區(qū)的土壤微生物細菌群落特征存在很多的共性，差異較小。

3 討論

3.1 降雨量和緯度對土壤微生物的影響

氣候條件和地理因素等自然條件是導致不同生態(tài)區(qū)土壤性質(zhì)存在差異的主要原因之一。研究區(qū)位于溫帶大陸性季風氣候區(qū)，因此土壤細菌微生物群落存在很多共性，但3個生態(tài)區(qū)存在一定的地域差異，任何環(huán)境變化都會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性有一定影響[21]。筆者研究表明氣候條件中降雨量和緯度對土壤細菌微生物構(gòu)成有顯著影響。已有研究表明降雨可改善土壤水分狀況，提高土壤微生物活性，甚至改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[22]。不同降雨條件下，真菌和細菌的優(yōu)勢種群和豐度差異顯著[14-15]。也有研究表明，隨著降雨量升高，土壤含水量升高，土壤微生物呼吸率變大[23]。土壤水分過多或缺乏，均會使土壤微生物量及其活性降低，微生物量周轉(zhuǎn)變慢，而適宜的土壤水分含量有利于微生物生長繁殖，進而導致土壤微生物量升高[24]。全球變暖必然導致氣候變化，其中降雨變化尤為突出，可能對土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深刻影響。緯度變化對土壤微生物的影響目前還沒有明確。但有研究發(fā)現(xiàn)土壤有機碳、總氮含量均隨緯度的升高而指數(shù)型減小[25]；李喜霞等[26]的結(jié)論卻相反，認為土壤有機碳含量、C/N比和C/P比隨緯度升高而顯著增加，這可能是因為2個研究點的環(huán)境差異明顯。該研究同時發(fā)現(xiàn)緯度與有機質(zhì)含量有協(xié)同效應(yīng)。

樣品編號首字母W代表西部地區(qū)；首字母C代表中部地區(qū)； 首字母E代表東部地區(qū)樣品。圖3 不同生態(tài)區(qū)細菌群落的PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA analysis of bacterial communities in different ecological regions

3.2 pH值、堿解氮和有機質(zhì)含量對細菌微生物的影響

土壤環(huán)境、動植物和微生物的生存條件由土壤理化性質(zhì)決定。吉林省3個不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤的pH值存在顯著差異，主要呈現(xiàn)自西向東遞減的趨勢；土壤肥力則從東向西逐漸遞減。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值對細菌微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響。有研究表明土壤pH值能提高土壤中細菌數(shù)量[27]。這是因為細菌喜堿性環(huán)境生長，土壤中的微堿性環(huán)境更有利于細菌的活動和繁殖。筆者研究也發(fā)現(xiàn)中、西部地區(qū)土壤細菌的群落豐度和群落多樣性高于東部地區(qū)。

除了自然因素外，人為因素對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了更嚴重的影響。GUO等[28]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)近20 a間我國耕地土壤酸化嚴重，pH值降低明顯。大量文獻證實土壤pH值會影響局部[29]、區(qū)域[30]和全球范圍[31]的細菌群落組成和多樣性，且過量、不合理使用氮肥等會導致土壤酶活性和土壤pH值降低，從而抑制土壤細菌生長[32]。該研究發(fā)現(xiàn)吉林省玉米種植區(qū)土壤中放線菌門占比隨pH值降低而明顯降低，放線菌主要能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛，可見未來土壤微生物的降解和分解能力也許會受影響。同時研究還發(fā)現(xiàn)堿解氮和有機質(zhì)含量對該區(qū)細菌微生物群落結(jié)構(gòu)也有顯著影響，這與SESSITSCH等[33]和LIU等[13]的研究結(jié)果一致?？赡芡寥廊腿己吭黾訛榧毦⑸锏纳L提供了充足的能源和碳源，促進了細菌數(shù)量的增加。

4 結(jié)論

吉林省不同生態(tài)區(qū)玉米種植土壤肥力呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢，中部半濕潤平原區(qū)的脲酶活性最低，蔗糖酶活性和堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)自西向東逐漸降低的趨勢，中性磷酸酶和酸性磷酸酶活性呈現(xiàn)自西向東逐漸增加的趨勢。中部半濕潤平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)的細菌多樣性顯著高于東部濕潤山區(qū)，細菌菌群豐度呈現(xiàn)自西向東逐漸降低的趨勢。3個生態(tài)區(qū)的優(yōu)勢細菌門均為變形菌和放線菌，而芽單胞菌和蒼白桿菌則是優(yōu)勢菌屬。放線菌門呈現(xiàn)自東向西逐漸增加的趨勢，變形菌門含量變化與之相反。芽單胞菌屬呈現(xiàn)中部半濕潤平原區(qū)>東部半濕潤山區(qū)>西部半干旱平原區(qū)的趨勢，蒼白桿菌屬呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢。典范分析結(jié)果表明，氣候影響因素中降雨量和緯度對細菌微生物群落組成影響較大，pH值、堿解氮和有機質(zhì)含量是土壤細菌優(yōu)勢類群變化的主要驅(qū)動因子。