鄧宇鵬，許 娜，婁 彤，劉崇東

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院，北京100020)

為了進一步了解PD-L1和CD8在卵巢癌中的表達情況以及評價其對預(yù)后的預(yù)測價值，我們建立了近10年來在我院完成初次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療的卵巢高級別漿液性癌患者的臨床病例資料庫，進行回顧性分析及隨訪調(diào)查，研究影響卵巢高級別漿液性癌患者預(yù)后的相關(guān)臨床及病理因素。同時制作卵巢高級別漿液性癌患者的病理組織芯片，通過免疫組織化學(xué)染色評價相關(guān)蛋白在卵巢癌病灶中的定位及表達水平情況，研究PD-L1和CD8在卵巢高級別漿液性癌中是否存在表達差異，同時分析蛋白表達強度與預(yù)后是否存在相關(guān)性，從而進一步驗證PD-L1和CD8是否可以預(yù)測卵巢高級別漿液性癌的預(yù)后，并為卵巢高級別漿液性癌的PD-1/PD-L1阻斷治療的響應(yīng)度提供預(yù)測價值。

1 材料和方法

1.1 病人來源

選取2010年1月至2019年1月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的高級別漿液性惡性腫瘤患者及病理資料。病人入選標(biāo)準(zhǔn)：(1) 在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院完成手術(shù)治療；(2) 術(shù)后病理證實為卵巢高級別漿液性癌；(3) 首次腫瘤減滅術(shù)后完成以鉑類為基礎(chǔ)的規(guī)范化化療；(4) 臨床資料完整。其中病理診斷不明確；合并其他類型卵巢良惡性腫瘤或其他器官原發(fā)惡性腫瘤；首次腫瘤減滅術(shù)術(shù)后未接受規(guī)范化化療；臨床資料不完整或標(biāo)本缺失的患者不納入本項研究。收集患者年齡、是否絕經(jīng)、術(shù)前CA125水平、有無新輔助化療及化療方案和療程、腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)滿意度(殘留病灶<1 cm、≥1 cm)、病理類型、FIGO 臨床分期(采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 FIGO-2014手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)重新分期[1])、有無腹水、腹水或腹腔沖洗液細(xì)胞學(xué)情況(陰性、陽性)、腫瘤包膜是否完整(包膜完整、術(shù)前自發(fā)破裂、術(shù)中破裂)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后化療方案及療程、化療效果(完全緩解、部分緩解、疾病進展、疾病穩(wěn)定)、有無復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)后治療等信息。治療后患者隨訪，前6個月隨訪每個月1次，后6個月每3個月隨訪一次，第2-5年每6個月隨訪1次，然后每1年1次。

1.2 組織芯片制作

取入組病人石蠟包埋組織標(biāo)本，進行病理復(fù)核并調(diào)取蠟塊，由病理科醫(yī)師根據(jù)切片 HE 染色結(jié)果在對應(yīng)的組織蠟塊(供體蠟塊)上進行癌灶定位并標(biāo)記，取樣針為直徑 1.0 mm，樣本間間距 1.0 mm，依據(jù)組織來源及病理號順序設(shè)計樣本序號排列，記錄每個樣本在陣列中的具體位置。使用手動式組織微陣列制作儀制作組織芯片，密封后置于 4℃冰箱內(nèi)長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化

取組織芯片切片，用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法檢測PD-L1及CD8的表達。兔抗人PD-L1抗體(CST)工作濃度為1:50和小鼠抗人CD8抗體工作濃度為1∶10。染色方法按SP試劑盒說明書進行。

1.4 組織芯片圖像掃描及免疫組化染色結(jié)果分析

將組織芯片掃描并用軟件自動程序進行分析。設(shè)置組織切片上所有的深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色細(xì)胞核為陰性。進而對每個組織點進行識別分析出強陽性，中度陽性，弱陽性及陰性的面積(單位：像素)，陽性的百分比，及最后進行組織化學(xué)評分(H-score)。H-score=(無著色腫瘤細(xì)胞百分率×0)+(弱著色腫瘤細(xì)胞百分率×1)+ (中度著色腫瘤細(xì)胞百分率×2)+(強著色腫瘤細(xì)胞百分率×3)。計算PD-L1在癌巢和間質(zhì)中的H-score，以中位數(shù)作為臨界值，≤中位數(shù)為低表達組，>中位數(shù)為高表達組。通過計數(shù)胞膜上有 CD8 陽性染色的淋巴細(xì)胞個數(shù)，檢測 CD8+ TILs 的浸潤情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用 SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差、頻數(shù)等對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

(1)PD-L1、CD8表達與卵巢高級別漿液性癌預(yù)后的生存分析：采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線(Kaplan-Meier survival analysis)，采用對數(shù)秩檢驗(Log-rank test)比較生存差異。分析PD-L1、CD8在卵巢高級別漿液性癌的不同患者中的表達強度是否與 PFS、OS 相關(guān)。

(2)PD-L1、CD8在卵巢高級別漿液性癌中的表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析：采用Spearman秩相關(guān)檢驗分析兩種蛋白表達強度/密度高低與臨床病理特征的相關(guān)性及兩者之間的相關(guān)性。

(3)PD-L1、CD8及臨床病理特征與卵巢高級別漿液性癌預(yù)后的多因素分析：將單因素分析中P<0.05的因素納入多因素回歸分析，采用 Cox 比例風(fēng)險回歸模型(Cox regression model)進行兩種蛋白及臨床病理特征與預(yù)后的多因素分析，評估預(yù)后因素作用。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

通過免疫組織化學(xué)染色，檢測PD-L1和CD8在卵巢高級別漿液性癌中的表達情況。2種蛋白在卵巢高級別漿液性癌中的免疫組織化學(xué)染色顯微圖像和H-score 評分/計數(shù)分別見圖1、表1和表2。

IJMN示病灶，KLOP示間質(zhì)。放大倍數(shù)：A-D/I-L×200，E-H/M-P×400。

PD-L1 蛋白表達主要定位于卵巢高級別漿液性癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。90例卵巢高級別漿液性癌患者的PD-L1染色H-score中位數(shù)為37.8(5-82)，以其作為臨界值將患者分為PD-L1高表達組和PD-L1低表達組，PD-L1 低表達組的病例為43(47.8%)例，H-score中位數(shù)18.2(5-37)，高表達組的病例為47(52.2%)例，H-score中位數(shù)55.4(39-82)。90例病理切片的CD8+ TILs的中位數(shù)為14.7(2-21)，以其作為臨界值將患者分為CD8+ TILs高密度組和CD8+ TILs低密度組；癌巢內(nèi) CD8+ TILs 高密度組的病例數(shù)為47(52.2%)例，CD8+ TILs計數(shù)中位數(shù)為16.5(15-21)個/HPF，低密度組病例數(shù)為43(47.8%)例，CD8+ TILs計數(shù)中位數(shù)為13.8(2-14)個/HPF；間質(zhì)內(nèi)CD8+TILs的中位數(shù)為15.8(2-28)個/HPF 。間質(zhì)中CD8+ TILs高密度的病例為46(51.1%)例，CD8+ TILs計數(shù)中位數(shù)19.7(16-28)個/HPF，CD8+ TILs低密度的病例為44(48.9%)例，CD8+ TILs計數(shù)中位數(shù)14.2(2-15)個/HPF。

2.2 PD-L1、CD8在卵巢高級別漿液性癌中的表達與預(yù)后

PD-L1、CD8在卵巢高級別漿液性癌中的表達情況見圖1，表達差異的生存曲線見圖2、圖3，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果提示:PD-L1低表達組的患者的5年生存預(yù)后均明顯高于高表達組(5年OS：77.3% vs 22.7%，P<0.001；5年P(guān)FS：56% vs 0%，P<0.001)。PD-L1低表達組和高表達組的總生存期分別為56.54±24.39月、40.19±24.18月，無進展生存期分別為31.74±18.31月、17.29±11.35月。分別計數(shù)癌巢和間質(zhì)內(nèi)CD8+TILs的數(shù)目，癌巢內(nèi)CD8+TILs高密度組的5年生存預(yù)后高于低密度組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(5年OS：51.4% vs 48.1%，P=0.794；5年P(guān)FS：43.3% vs 29.5%，P=0.415)。癌巢內(nèi)CD8+TILs高密度組和低密度組的總生存期分別為43.32±24.63月、37.35±24.02月，無進展生存期分別為32.85±21.67月、30.53±22.89月。間質(zhì)內(nèi)CD8+TILs高低密度對OS、PFS無明顯影響(P=0.770、P=0.571)。

表1 PD-L1在卵巢高級別漿液性癌中的H-score

表2 CD8+ TILs在卵巢高級別漿液性癌中的計數(shù)

圖2 PD-L1、CD8表達差異的OS生存曲線

圖3 PD-L1、CD8表達差異的PFS生存曲線

2.3 PD-L1、CD8表達與卵巢高級別漿液性癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性分析

統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果提示:PD-L1表達與患者具有惡性腫瘤病史(P=0.017，r=0.251)有相關(guān)性，與FIGO分期(P=0.045，rs=0.212)有相關(guān)性。癌巢內(nèi)CD8+TILs的密度與臨床病理特征均無明顯相關(guān)性。癌巢內(nèi)CD8+TILs的密度與PD-L1表達有負(fù)相關(guān)性(P=0.038，rs=-0.219)。

2.4 PD-L1、CD8表達與卵巢高級別漿液性癌患者的預(yù)后的多因素分析

分別以卵巢高級別漿液性癌復(fù)發(fā)和患者死亡為因變量，以在單因素分析中具有顯著差異的臨床病理特征變量及三種蛋白的表達為協(xié)變量，采取 Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析，用 Wald 檢驗對變量進行篩選。PFS和OS相關(guān)危險因素多因素分析見表4。

其中PFS相關(guān)的Cox 比例風(fēng)險回歸統(tǒng)計得到的結(jié)果如下：PD-L1表達、腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)滿意度、新輔助化療進入 Cox 模型(P值分別為<0.001、0.001和0.038)。與OS相關(guān)的 Cox 比例風(fēng)險回歸統(tǒng)計得到的結(jié)果如下：PD-L1表達進入 Cox 模型(P<0.001)。

表3 PD-L1、CD8表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析

表4 PD-L1、CD8表達及臨床病理特征與預(yù)后的多因素分析

3 討論

免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控的作用，而免疫逃逸是指通過降低腫瘤細(xì)胞的免疫原性來促進腫瘤細(xì)胞存活。腫瘤細(xì)胞通過表達PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，使T細(xì)胞功能處于抑制狀態(tài)，從而發(fā)生免疫逃逸[2]。TILs是一類浸潤到腫瘤細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等具有特異性殺傷腫瘤功能的細(xì)胞[3]。CD8+TILs，又稱為細(xì)胞毒T細(xì)胞，在機體識別抗原后能夠?qū)в邢鄳?yīng)抗原的細(xì)胞發(fā)揮特異性殺傷作用，是機體抗腫瘤免疫的核心執(zhí)行者。正常組織極少表達 PD-L1，與其他惡性腫瘤包括肺癌(50%)、食管癌(44%)、胃癌(42%)、乳腺癌(34%)和腎癌(37%)相比[4-8]，PD-L1在卵巢癌中的表達率最高[9]。然而目前的臨床試驗中，卵巢癌對PD-L1阻斷治療的響應(yīng)度并不理想，這提示我們卵巢癌中可能存在其他抗腫瘤免疫的不利因素，如殺傷腫瘤細(xì)胞的執(zhí)行者CD8+TILs的數(shù)目/密度，或其他對抗腫瘤免疫具有負(fù)調(diào)控作用的因子。多項研究表明腫瘤浸潤性CD8+TILs的數(shù)量越多，即腫瘤組織中的免疫儲備力量越多，患者使用PD-L1抗體的治療反應(yīng)的預(yù)測性更好。這意味著PD-L1和CD8+TILs可以聯(lián)合預(yù)測腫瘤患者對PD-L1阻斷治療的響應(yīng)度。

Hamanishi[10]等曾報道，該團隊檢測了70例不同病理類型石蠟包埋的上皮性卵巢癌組織標(biāo)本，PD-L1高表達的患者預(yù)后明顯差于低表達者。因卵巢癌不同病理類型的異質(zhì)性較大，如前述研究中，不同病理類型卵巢癌PD-L1表達有明顯差異，80%以上卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌高表達PD-L1，卵巢漿液性癌PD-L1的高表達率約60%，而卵巢黏液性腺癌PD-L1高表達率<10%。因此本研究中僅選用卵巢高級別漿液性癌一種病理類型的病例。

目前已知PD-L1的表達上調(diào)方式可能有 2 種，即固有表達及適應(yīng)性免疫抵抗途徑。固有表達指腫瘤細(xì)胞的癌基因通路啟動了PD-L1表達，這種情況下PD-L1往往在癌細(xì)胞呈彌漫性表達[11]。腫瘤細(xì)胞PD-L1表達上調(diào)的另一種機制是適應(yīng)性免疫抵抗，干擾素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性高表達PD-L1，PD-L1使表達PD-1的T細(xì)胞功能耗竭或無能。此種表達有特征性表現(xiàn)，即PD-L1往往在腫瘤組織T細(xì)胞富集區(qū)，尤其腫瘤侵襲邊緣局限表達或高表達。在本研究中，PD-L1在腫瘤組織中的表達主要為彌漫性表達，局灶性表達較少見。因此，以PD-L1表達H-score評分的中位數(shù)作為高低表達的臨界值，結(jié)果具有可比性。本研究中，PD-L1高表達患者的預(yù)后明顯差于低表達患者。這表明PD-L1表達與卵巢癌患者的預(yù)后存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能反映了宿主抗腫瘤免疫功能的抑制程度。

此外，本研究在分別分析間質(zhì)和癌巢內(nèi)的CD8+TILs密度高低對患者的生存預(yù)后的影響時發(fā)現(xiàn)，二者對患者生存預(yù)后的影響均不顯著，即腫瘤中的CD8+TILs密度似乎與患者的生存預(yù)后無關(guān)。由此可見，單純的癌巢CD8+TILs密度并不能作為預(yù)測卵巢漿液性癌患者預(yù)后的指標(biāo)，其抗腫瘤免疫效應(yīng)不僅受細(xì)胞密度、也受到功能狀態(tài)的影響。此外本研究中還發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達與癌巢中CD8+TILs存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示PD-L1的表達抑制了抗腫瘤的CD8+TILs在腫瘤組織中的浸潤，通過這一方式繼續(xù)影響其發(fā)揮抗腫瘤作用。多因素分析還顯示PD-L1高表達是影響患者PFS、OS的獨立危險因素，因此明確腫瘤組織PD-L1表達情況具有重要的臨床意義。

綜上所述，卵巢高級別漿液性癌的腫瘤組織中的PD-L1的表達與患者預(yù)后密切相關(guān)，是影響患者PFS、OS的獨立危險因素；PD-L1表達與癌巢中CD8+TILs存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示PD-L1的表達不僅直接影響CD8+TILs細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)，還間接抑制了其在腫瘤組織中的浸潤，對于影響CD8+TILs功能的因素及相關(guān)分子標(biāo)記物還需進一步研究。因此，重視卵巢癌腫瘤組織中的分子標(biāo)記物檢測有助于評估患者預(yù)后。近年來免疫治療日益成為惡性腫瘤的重要治療手段，作為一種高度個體化的治療方案，期待有更深入的基礎(chǔ)研究預(yù)測患者對免疫治療的響應(yīng)度和大規(guī)模臨床試驗來探索抗PD-1/PD-L1免疫治療在卵巢癌治療中的價值。