何文妮 ， 陳開意 ， 邵 波

(浙江樹人大學(xué) ， 浙江 杭州 310015)

紫外線吸收劑是一種可以用來吸收紫外線的有機(jī)紫外線屏蔽劑。近年來由于紫外線增強(qiáng)，有機(jī)紫外線吸收劑被人們大量使用，又通過多種途徑將其帶入水體，于是在水體中被檢測(cè)出[1]。目前，各國(guó)已經(jīng)普遍存在有機(jī)紫外防曬劑的環(huán)境污染問題，有機(jī)紫外防曬劑的殘留幾乎在所有類型的水體中都可以被檢測(cè)到，并且濃度呈上升趨勢(shì)[2]。水生生物能夠不斷地將有機(jī)紫外防曬劑累積在體內(nèi)，通過食物鏈來產(chǎn)生生物放大作用，最終還有可能會(huì)產(chǎn)生環(huán)境類激素。一些常用有機(jī)防曬劑的毒性包括內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、生殖、發(fā)育毒性及光致毒性等，影響水生生物的生殖、發(fā)育[3]。對(duì)氨基苯甲酸(PABA)、BP-1、BP-3等有機(jī)紫外線防曬劑對(duì)人或動(dòng)物的雌激素、雄激素、孕激素和甲狀腺激素系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生一定的干擾作用[4]。有研究表明，具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的有機(jī)紫外防曬劑可能會(huì)對(duì)人體的健康造成一定的威脅[5]。含有熒光物質(zhì)的分子與溶劑分子之間所發(fā)生的物理或化學(xué)作用，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度或熒光峰位發(fā)生變化的過程被稱為熒光猝滅作用。酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸都含有芳香環(huán)，所以它們都屬于芳香族氨基酸，這也是蛋白質(zhì)中熒光的主要來源。氨基酸殘基在蛋白質(zhì)與小分子發(fā)生作用時(shí)，會(huì)對(duì)微環(huán)境的變化變得十分敏感，這使得蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度或者熒光峰位發(fā)生改變，可以通過分析其熒光光譜的特征來了解二者之間存在的相互作用。往往可以通過研究有機(jī)紫外防曬劑與蛋白質(zhì)之間的作用，而得知其在人體或動(dòng)物體內(nèi)的運(yùn)輸及分布情況，這也對(duì)于闡明有機(jī)紫外防曬劑的毒性有著重大意義。目前，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道有機(jī)紫外防曬劑與牛血清白蛋白的相互作用可以通過熒光光譜法來研究[6]。通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)有機(jī)紫外線防曬劑與相關(guān)物質(zhì)反應(yīng)時(shí)能夠利用熒光效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)擬用熒光猝滅的方法來探究對(duì)氨基苯甲酸與牛血清白蛋白分子間相互作用的熒光分析，以應(yīng)用于實(shí)際。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

F-4600型熒光分光光度計(jì)，日本日立，AL204型Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；BCD-216ZDJ型的冰箱，青島海爾股份有限公司；DK-8D型數(shù)控超級(jí)恒溫槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Paoifio-T-2-20型純水機(jī)，PHSJ-4F型PH計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

PABA，上海生物工程有限公司，進(jìn)口分裝，100g，純度>99%，BSA，上海生物工程有限公司，用Tris-HCl緩沖液配制 1×10-5mol/L的BSA溶液。實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)氨基苯甲酸溶液(1.0×10-2mol/L)的配制：取0.137 14 g的對(duì)氨基苯甲酸，用超純水溶解，100mL的容量瓶中稀釋定容至刻度線，搖勻后，放于4 ℃冰箱中保存。

0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液：稱取24.228 g的Tris藥品倒入1 L的大燒杯內(nèi)，加入超純水溶解，將超純水加至約700 mL，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至6.25±0.05，最后用超純水1 000 mL的容量瓶中稀釋定容至刻度線，搖勻后，放至室溫下。

牛血清白蛋白(BSA)溶液(1.0×10-5moL/L)的配制：取0.068 g BSA，用Tris-HCL緩沖溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，并于5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

在10 mL比色管中分別加入5 mL的BSA溶液以及適量的PABA溶液，用超純水定容并搖勻，使PABA的終濃度分別為 0、1.8×10-4、2.7×10-4、3.6×10-4、4.5×10-4、5.4×10-4、6.3×10-4、7.2×10-4mol/L。搖勻后，靜置25 min使溶液混合均勻并充分反應(yīng)，再倒入石英比色皿中，放入熒光分光光度計(jì)中，設(shè)定參數(shù)(光譜通帶10 nm，λex=280 nm，λem=345 nm，掃描速率=240 nm/min)，測(cè)定熒光分光光譜。

1.4 同步熒光實(shí)驗(yàn)

在298 K的溫度條件下，按照與熒光猝滅相同的實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)定同步熒光的測(cè)定參數(shù)，即分別掃描在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm兩種試驗(yàn)條件下，在250～350 nm內(nèi)樣品溶液的同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

2.1.1不同濃度梯度下PABA對(duì)BSA的影響

蛋白質(zhì)大分子之所以可產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，是因其具有酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等小分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與外源性化合物互相作用時(shí)可能會(huì)降低蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度。BSA的內(nèi)源性熒光峰位呈現(xiàn)出有規(guī)律地下降，表示發(fā)生了熒光猝滅作用。同時(shí)BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著對(duì)氨基苯甲酸濃度的升高，呈有規(guī)律性的降低，并且激發(fā)峰與發(fā)射峰的位置與形狀幾乎是一致的，這說明對(duì)氨基苯甲酸與牛血清白蛋白分子發(fā)生反應(yīng)時(shí)存在著熒光猝滅的作用。

在298 K溫度下，向BSA中分別加入不同濃度的PABA后，BSA在345 nm附近熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，出現(xiàn)了熒光峰值；蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰隨著PABA濃度的升高，發(fā)生了明顯的猝滅現(xiàn)象，熒光峰值的位置卻沒有出現(xiàn)明顯的變化。這是由于加入的PABA與 BSA發(fā)生熒光猝滅作用，致使其內(nèi)源性熒光峰值有規(guī)律地下降，且BSA的熒光猝滅程度隨著PABA濃度的升高在不斷地加劇。298 K時(shí)PABA與BSA發(fā)生的熒光猝滅作用見圖1。

圖1 PABA對(duì)BSA熒光猝滅的影響

2.1.2作用時(shí)間的影響

在298 K條件下，BSA的濃度1.0×10-5mol/L，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，345 nm處測(cè)定加入一定量的PABA對(duì)BSA熒光猝滅作用的強(qiáng)度隨時(shí)間的變化如圖2所示。

圖2 PABA對(duì)BSA熒光猝滅作用隨時(shí)間的變化

由圖2可知，PABA與BSA的反應(yīng)，熒光強(qiáng)度在剛開始時(shí)最強(qiáng)，到25 min時(shí)，反應(yīng)已經(jīng)趨于穩(wěn)定，因此在反應(yīng)25 min后可以測(cè)定。

2.1.3pH值的影響

在pH值為3.75～9.05時(shí)，分別測(cè)定加入PABA前，BSA在Δλ=15 nm下的同步熒光光譜和加入PABA后，BSA在Δλ=15 nm下的同步熒光光譜，分析兩者的熒光差值ΔF與pH值之間的關(guān)系，可以看出PABA對(duì)BSA色氨酸殘基在不同pH值條件下熒光峰值的影響[7]，見圖3。

圖3 PABA對(duì)BSA熒光猝滅作用隨pH的變化譜圖

由圖3可知，在加入PABA前與加入PABA后，BSA色氨酸殘基在345 nm處相對(duì)熒光峰值變化較大的是在pH值=5～8時(shí)，所測(cè)得的ΔF的變化最大，是在pH值=6.0～6.5，因此本文將pH值=6.25作為工作酸度。

2.2 確定牛血清白蛋白參與反應(yīng)的基團(tuán)

有研究發(fā)現(xiàn)，能發(fā)射熒光的氨基酸殘基存在于BSA分子中，例如酪氨酸殘基、色氨酸殘基和苯丙氨酸殘基等。色氨酸殘基、酪氨酸殘基和苯丙氨酸殘基這三者的相對(duì)熒光峰值比值為100∶9∶0.5，此處苯丙氨酸殘基相對(duì)于色氨酸殘基、酪氨酸殘基而言可以忽略不計(jì)，因此主要是色氨酸殘基與酪氨酸殘基影響B(tài)SA的熒光光譜的峰值[8]。為探究是哪種氨基酸殘基對(duì)BSA分子產(chǎn)生影響，需要進(jìn)行熒光猝滅反應(yīng)。

2.2.1在不同pH值條件下，PABA對(duì)BSA的酪氨酸殘基的影響

在pH值為2.75～9.05時(shí)，分別測(cè)定加入PABA 前，BSA在Δλ=15 nm下的同步熒光光譜和加入PABA后，BSA在Δλ=15 nm下的同步熒光光譜，分析兩者的熒光差值ΔF與pH值之間的關(guān)系，可以看出PABA對(duì)BSA酪氨酸殘基在不同pH值條件下熒光峰值的影響[9]。如圖4所示。

圖4 不同pH值條件下，PABA對(duì)BSA的酪氨酸殘基的同步熒光光譜圖

加入PABA前與加入PABA 后，BSA酪氨酸殘基在Δλ=15 nm下的相對(duì)熒光峰值基本上沒有表現(xiàn)出任何變化，并且PABA與BSA分子兩者的反應(yīng)不因pH值的改變有所影響，因此可以排除掉BSA的酪氨酸殘基參與到此熒光猝滅反應(yīng)中來的可能。

2.2.2在不同pH值條件下，PABA對(duì)BSA色氨酸殘基的影響

在pH值為4.50～9.05時(shí)，分別測(cè)定加入PABA前，BSA在Δλ=60 nm情況下的同步熒光光譜和加入PABA后，BSA在Δλ=60 nm情況下的同步熒光光譜。如圖5所示。ΔF為加入PABA前后的熒光差值，分析ΔF與pH值之間的關(guān)系，可以觀察到在不同pH值條件下猝滅劑(PABA)對(duì)BSA色氨酸殘基熒光峰值存在不同程度的影響[10]。

圖5 不同pH值條件下，PABA對(duì)BSA的色氨酸殘基同步熒光光譜圖

由圖5可知，加入PABA前與加入PABA后的熒光差值，在Δλ=60 nm的情況下，BSA色氨酸殘基的ΔF在pH值為6.0～7.5時(shí)存在著較為明顯的變化，并且在pH值6.0～6.5內(nèi)的變化最顯著。因此可以說明，在相對(duì)適宜酸度的情況下，BSA色氨酸殘基參加了猝滅反應(yīng)。由此可以推測(cè)出主要是因?yàn)镻ABA與BSA的色氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所以PABA與BSA分子反應(yīng)時(shí)發(fā)生了熒光猝滅作用，從而導(dǎo)致了BSA熒光強(qiáng)度的降低。

2.3 熒光猝滅類型的判斷

2.3.1動(dòng)態(tài)猝滅

通常產(chǎn)生熒光猝滅的原因有動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅及動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的聯(lián)合猝滅[11]。動(dòng)態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子(例如BSA)與猝滅劑(例如PABA)兩者產(chǎn)生碰撞，降低了前者自身的熒光峰值的過程。碰撞猝滅屬于熒光動(dòng)態(tài)猝滅中的一種，即處于激發(fā)態(tài)的熒光分子(BSA)與猝滅劑分子(PABA)產(chǎn)生碰撞，激發(fā)態(tài)熒光分子將熱量釋放到環(huán)境中，最后又以無輻射的方式躍遷回到基態(tài)而產(chǎn)生的猝滅作用。其規(guī)律遵從 Stern-Volmer 方程[12]：

(1)

式中，F(xiàn)是加入不同濃度藥物后的熒光峰值；F0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光峰值；Kq為靜態(tài)猝滅常數(shù)；τ0為不存在猝滅劑時(shí)BSA的平均壽命；[Q]為藥物的濃度；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。根據(jù)上式所得的結(jié)果，以[Q]為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)作Stern-Volmer圖。生物大分子的熒光存在時(shí)間一般為10-8s，可以用來計(jì)算猝滅速率常數(shù)，結(jié)果如圖6所示。cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25。

圖6 PABA與BSA反應(yīng)的Stern-Volmer圖

根據(jù)上述方法測(cè)得Kq為19.6×1010L/mol·s，>2.0×1010L/mol·s的經(jīng)驗(yàn)最大值，因而可推測(cè)出并不是因動(dòng)態(tài)猝滅而導(dǎo)致PABA對(duì)BSA分子熒光的猝滅。

2.3.2靜態(tài)猝滅

基態(tài)熒光分子跟猝滅劑兩者相結(jié)合而形成不發(fā)熒光的物質(zhì)，且該物質(zhì)會(huì)降低基態(tài)熒光分子的熒光峰值，該過程為熒光靜態(tài)猝滅，可通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程進(jìn)行表示[13]：

(2)

式中：F0為加入猝滅劑前的熒光峰值，F(xiàn)為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；復(fù)合物在靜態(tài)熒光猝滅時(shí)所生成的形成常數(shù)為K，單位是L/mol，[Q]為熒光猝滅劑的濃度，可以通過K來反映靜態(tài)猝滅過程中在結(jié)合反應(yīng)平衡時(shí)的量效關(guān)系。

注：cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25

在一個(gè)供體熒光分子與另一個(gè)受體熒光分子的激發(fā)光譜發(fā)生重合的情況下，供體熒光分子的激發(fā)會(huì)使得受體熒光分子發(fā)出熒光，而供體熒光分子自身的熒光峰值卻在降低，這便是熒光能量轉(zhuǎn)移的過程。熒光能量轉(zhuǎn)移具有輻射能量轉(zhuǎn)移與非輻射能量轉(zhuǎn)移之分。若要判斷是否有輻射能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，就要觀察熒光猝滅光譜圖的形狀是否正常。如圖7所示。BSA的熒光光譜的形狀正常，表示并沒有發(fā)生畸變，因此PABA與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移不屬于輻射能量轉(zhuǎn)移。非輻射能量的轉(zhuǎn)移方式也分為兩種，即分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移與分子間能量轉(zhuǎn)移。綜上所述可以推測(cè)，BSA熒光供體與PABA熒光受體它們兩者之間應(yīng)該是形成了復(fù)合物，PABA與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移為分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移。

2.4 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

為了計(jì)算對(duì)氨基苯甲酸在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，可運(yùn)用Double-Logarithm公式進(jìn)行計(jì)算。假設(shè)PABA與BSA能形成含n個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物，且該復(fù)合物不發(fā)熒光，條件穩(wěn)定常數(shù)為K，根據(jù)化學(xué)平衡及熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系可得[14]：

(3)

式中：F0無猝滅劑(PABA)時(shí)的熒光峰值；F為有猝滅劑(PABA)時(shí)的熒光峰值；Ka，結(jié)合常數(shù)；n，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]，猝滅劑濃度，mol/L。

注：cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25

PABA與BSA之間的聯(lián)結(jié)位點(diǎn)數(shù)基本為1，這就說明PABA與BSA之間只存在一種類型的聯(lián)結(jié)位點(diǎn)。

2.5 PABA與BSA的同步熒光作用機(jī)理

可用同步熒光作用來研究生物大分子發(fā)光官能團(tuán)受外源小分子加入后微環(huán)境的變化。為了做到同時(shí)掃描激發(fā)波長(zhǎng)的熒光光譜和發(fā)射波長(zhǎng)的熒光光譜，我們可以用同步熒光法，普遍的熒光測(cè)定方法尚未做到這一點(diǎn)。之后以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，其設(shè)定的波長(zhǎng)范圍為橫坐標(biāo)來繪制熒光光譜圖，稱為同步熒光光譜法。由于酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等氨基酸小分子結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)可以發(fā)出內(nèi)源性熒光主要結(jié)構(gòu)。普通光譜中不能明顯地區(qū)分開兩種內(nèi)源性熒光的發(fā)射峰，因此不能獲得精確的熒光數(shù)據(jù)，然而同步熒光光譜能夠有效地將兩者分開。不同濃度條件下的PABA作用于BSA時(shí)產(chǎn)生的同步熒光光譜圖如圖9所示。固定的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)兩者之間的差比可用Δλ來表示，酪氨酸殘基的同步熒光光譜特征只在Δλ=15 nm的情況下表現(xiàn)出來，而色氨酸殘基的同步熒光光譜特征只在Δλ=60 nm的情況下顯示。在確定BSA的濃度后，逐步添加PABA的濃度，分別繪制在25 ℃下PABA與BSA反應(yīng)時(shí)Δλ=15 nm、Δλ=60 nm同步熒光光譜圖，結(jié)果如圖10所示。

圖9 Δλ=15 nm PABA對(duì)BSA的同步熒光

圖10 Δλ=60 nm PABA 對(duì)BSA的同步熒光

圖9、圖10中，對(duì)氨基苯甲酸的濃度從1到8的分別為0、1.8×10-4、2.7×10-4、3.6×10-4、4.5×10-4、5.4×10-4、6.3×10-4、7.2×10-4mol/L，BSA的濃度始終為1×10-5mol/L。從圖9、圖10中可以看出，在加入PABA前色氨酸的最大峰高在400左右，結(jié)合同步熒光光譜可得，通過同步熒光光譜圖可以了解到Δλ=15 nm時(shí)藥物與BSA相互作用的熒光峰值基本低于Δλ=60 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度，從而得出BSA中的色氨酸殘基是引起B(yǎng)SA熒光強(qiáng)度變化的主要結(jié)構(gòu)，并且色氨酸的最大峰值和牛血清蛋白的熒光峰值相接近，且變化趨勢(shì)大致相近，由此可以判斷PABA與牛血清蛋白的作用位置較靠近蛋白分子上的色氨酸殘基。Δλ=60 nm時(shí)，PABA的峰位置都發(fā)生了一點(diǎn)偏移，位點(diǎn)發(fā)生了偏移說明了在的微環(huán)境條件下，色氨酸殘基上存在的水溶性增強(qiáng)，疏水作用減弱，由此又可以推斷出PABA能夠改變BSA的分子結(jié)構(gòu)，形成了一種新的構(gòu)造[15]。Δλ=15 nm時(shí)，不同濃度的同步熒光光譜峰值不斷減小，但是峰的位置并沒有發(fā)生偏移。

3 結(jié)論

利用熒光光譜法研究了不同濃度、不同反應(yīng)時(shí)間及不同pH值下對(duì)氨基苯甲酸與牛血清白蛋白分子間的相互作用。研究結(jié)果表明，PABA會(huì)使得BSA分子自身的熒光明顯猝滅，這種猝滅作用會(huì)隨猝滅劑濃度的升高而增強(qiáng)。PABA與BSA分子反應(yīng)25 min時(shí)，BSA的熒光峰值在345 nm處已經(jīng)趨于穩(wěn)定，因此在反應(yīng)25 min后可以測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中ΔF的變化最大是在pH值=6.0～6.5 附近，因此本文將pH=6.25作為工作酸度。PABA與BSA的色氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所以對(duì)于BSA熒光峰值有猝滅作用，從而導(dǎo)致其熒光峰值的下降，該過程為靜態(tài)猝滅，即猝滅作用由二者形成了新的復(fù)合物而引起；PABA與BSA有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可與BSA形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述，對(duì)氨基苯甲酸能與牛血清白蛋白分子能發(fā)生熒光猝滅作用。研究表明牛血清白蛋白與人血清白蛋白的同源性高達(dá)76.52%，通過本次研究提示，有機(jī)紫外防曬劑能在人體中通過血清白蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存，我們應(yīng)當(dāng)重視其對(duì)人體的可能存在的危害[16]。目前來看，還缺少對(duì)有機(jī)紫外防曬劑等個(gè)人護(hù)理品成分對(duì)人體非靶標(biāo)組織細(xì)胞影響的足夠認(rèn)識(shí)，今后仍需要深入探究個(gè)人護(hù)理品成分在人體(特別是嬰幼兒以及孕婦等敏感人群)內(nèi)暴露情況，從而進(jìn)一步闡明其對(duì)人體可能存在的健康風(fēng)險(xiǎn)。