陳 健，谷孝艷，韓 玲，郝曉艷，劉曉偉，張 燁，韓建成，何怡華

原發(fā)性心臟腫瘤是一種罕見疾病，嬰幼兒發(fā)病率約為0.25%，而尸檢結果其發(fā)病率更低，約為0.002%[1]。隨著產前檢測技術的發(fā)展，近年來越來越多的胎兒心臟腫瘤被發(fā)現和報道，其中絕大部分為超聲檢出，尤其是胎兒超聲心動圖(fetal echocardiography，FE)[2]。大多數原發(fā)性心臟腫瘤都是良性，其中最常見為橫紋肌瘤，其次為畸胎瘤、纖維瘤、血管瘤、嗜酸性細胞心肌增生(癥)、黏液瘤等；極少數為惡性腫瘤，如橫紋肌瘤肉瘤、纖維肉瘤等[2-3]。多數心臟腫瘤對心臟本身的影響較小，常見的心臟腫瘤并發(fā)癥為心臟雜音、心包積液、心律失常、瘤體引起的機械梗阻及心力衰竭等，其治療措施在妊娠期比較有限，少數位于胎兒心包腔的腫瘤如畸胎瘤可以在妊娠期手術切除，多數需要在產后進行處理，通常預后良好[4]。

心臟腫瘤也可以是一些系統性遺傳疾病的首發(fā)癥狀，如結節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex，TSC)、家族性黏液瘤綜合征(呈多系統黏液瘤樣表現，可累計皮膚、羊膜、心臟、乳房、腎上腺、垂體及睪丸等)、痣樣基底細胞癌綜合征和Beckwith-Wiedemann綜合征(巨大兒、巨舌癥、臍膨出)等[5]，其中與TSC密切相關的腫瘤最常見的為心臟橫紋肌瘤[6]。TSC是一種常染色體顯性遺傳疾病，累及多系統，常常預后不良，目前發(fā)現TSC1和TSC2基因與其存在密切的關系，2012年國際TSC大會已經將TSC1和TSC2基因的致病性突變作為一項單獨的診斷標準[7-8]。

本研究的目的是篩選臨床通過超聲心動圖檢出的胎兒心臟腫瘤病例，對其超聲心動圖及其對應的病理檢測結果進行分析，同時進行家系遺傳學檢測，深入探討胎兒心臟腫瘤的發(fā)病特點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選2015年9月—2018年2月38例因胎兒心臟腫瘤來北京安貞醫(yī)院母胎醫(yī)學會診中心就診的孕婦及其家系入組。所有胎兒均在本中心接受了胎兒超聲心動圖檢查，均診斷出單發(fā)或多發(fā)心臟腫瘤。同時經知情同意，所有家系均選擇在產前或產后接受家系TSC目標基因檢測。根據2012年國際TSC協會發(fā)布的TSC診斷修訂標準，入選的胎兒及父母均需要完善相關檢查，對其臨床表型進行確認。

1.2 知情同意 本研究經首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準。所有接受基因檢測的病人或監(jiān)護人均需要簽署知情同意書，胎兒病理解剖需要家屬簽署病理解剖知情同意書，對于無法簽署上述知情同意的家系將不納入本研究。

1.3 胎兒超聲心動圖檢測 使用GE-E8超聲診斷儀，RAB 4-8-D三維容積探頭，Fetal Heart模式，根據2013國際婦產科超聲協會(International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG) FE指南采集各個標準切面圖像，主要包括：心尖或肋下四腔心切面、主動脈長軸切面、肺動脈長軸切面、心室短軸切面、大血管短軸切面、主動脈弓切面、導管弓切面、上下腔靜脈切面和三血管切面；重點觀察心腔及心肌內有無占位性病變[9]。

1.4 樣本采集 對孕婦及其家屬采集外周血進行基因檢測，用4 mL乙二胺四乙酸(ethylene diaminete traacetic acid，EDTA)抗凝管采集血樣，每人兩管；通過羊水穿刺/臍帶血管穿刺抽取胎兒羊水/臍帶血來進行疑似TSC的胎兒目標基因檢測，羊水采集量為20 mL，臍帶血采集量為4 mL。對于選擇終止妊娠的孕婦，對胎兒進行病理解剖并取樣送檢基因，取樣部位為胎兒皮膚、心肌及臍帶組織，每個部位大小為5 mm×5 mm。

血液樣品使用冰盒運輸，24 h內送達實驗室進行分析。羊水樣品要求采集后2 h內進行離心處理，然后使用冰盒運輸，24 h內送達實驗室進行分析。

1.5 基因檢測 使用標準程序從組織、羊水/臍帶血、外周血樣里提取DNA。本測試采用自主研發(fā)的探針捕獲試劑，針對引起多發(fā)性結節(jié)硬化癥的TSC1、TSC2基因，進行全基因序列捕獲，覆蓋區(qū)域約為368 kb。富集后在Illumina HiSeq 2500測序平臺進行高通量測序，平均覆蓋深度大于100X。對原始測序數據進行低質量的過濾，然后利用標準生物信息分析流程對變異位點進行檢出、過濾和注釋。

變異位點過濾標準包括人群數據庫中頻率(ExAC或千人基因組)<5%、最小覆蓋深度為20X，變異功能變化(非同義突變、剪切位點變化、無義突變、移碼突變等)等。使用BWA將測序結果與人類基因組序列(hg19)比對，通過samtools和pindel軟件工具找出相關突變；接著結合dbSNP、OMIM及swissVar數據庫對檢出突變進行進一步過濾；最后使用Provean和SIFT軟件對突變的致病性進行預測。所有被檢出的致病突變和疑似致病突變均再次進行Sanger測序驗證。

1.6 統計分析 臨床醫(yī)生與基因分析專員會對檢出突變的生物信息、病人臨床表型、臨床癥狀以及就診治療情況進行綜合分析，基于以上信息綜合做出遺傳學診斷和預后分析。

2 結 果

2.1 胎兒及其家系檢測分析 共檢測分析了38例胎兒及其家系(見表1)。入選孕婦年齡19～42歲，中位數為28歲；孕齡23～38周，中位數為27周。所有胎兒均經胎兒超聲心動圖檢出心臟腫瘤，其中多發(fā)腫瘤30例，單發(fā)腫瘤8例。所有38例胎兒均成功接受了基因檢測，其中產前羊水穿刺或臍帶血穿刺取樣6例，32例為引產后提取胎兒相關DNA樣本。最終38例孕婦及家屬均決定終止妊娠，并且接受了胎兒病理解剖。

表1 38例胎兒心臟腫瘤一般資料、超聲及臨床特點

(續(xù)表)

2.2 胎兒超聲心動圖檢測結果 38例胎兒心臟腫瘤中，多發(fā)性腫瘤30例，單發(fā)性腫瘤8例。腫瘤以多發(fā)為主，最常累及的位置是左室，累及次數為33次，其次是右室，累及次數為23次；腫瘤最大徑約為33.0 mm，最小徑為4.6 mm；大多數腫瘤位于心腔內或心肌，與正常心肌組織分界尚清，僅有1例出現向外生長累及心包腔的情況。8例(15%)胎兒出現心臟腫瘤并發(fā)癥，其中，4例瘤體引起的機械梗阻，3例心包積液，1例心律失常。其中12號家系胎兒的心臟腫瘤與主動脈瓣關系緊密，并有輕度的粘連，導致明顯的左室流出道梗阻。這8例存在心臟腫瘤并發(fā)癥的家系均選擇終止妊娠，病理結果顯示其心臟腫瘤均為橫紋肌瘤。典型胎兒超聲心動圖見圖1、圖2。

圖1 胎兒超聲心動圖四腔心切面(一)

圖2 胎兒超聲心動圖四腔心切面(二)

2.3 胎兒心臟腫瘤病理及基因檢測結果 38例胎兒心臟腫瘤家庭均選擇終止妊娠，并接受了胎兒心臟病理檢查，結果顯示其中36例為橫紋肌瘤(其中多發(fā)橫紋肌瘤29例，單發(fā)橫紋肌瘤7例，見圖 3)，1例為多發(fā)性血管瘤，1例為單發(fā)性纖維瘤(見表2)。TSC基因檢測結果顯示，除1例血管瘤和1例纖維瘤外，橫紋肌瘤病例中，29例多發(fā)橫紋肌瘤TSC基因陽性27例(93%，27/29)，7例單發(fā)橫紋肌瘤TSC基因檢測陽性5例(5/7)。4例胎兒橫紋肌瘤家系基因檢測結果均為陰性，其中單發(fā)和多發(fā)橫紋肌瘤各2例。

圖3 胎兒大體解剖圖

表2 38例胎兒心臟腫瘤病理類型與基因對照 單位：例

2.4 TSC1和TSC2基因家系檢測結果 38例胎兒及父母均接受了TSC1和TSC2目標基因檢測，其中通過32例為引產后提取胎兒相關DNA樣本，4例為產前臍帶血管穿刺取樣，2例為通過產前羊水穿刺取樣。共有32例胎兒TSC基因檢測陽性，TSC1突變5例，TSC2突變27例，均為致病或疑似致病的突變，在基因學方面可確診TSC。在上述32個突變中，新發(fā)突變20例，家系遺傳突變12例(見表3)。少數胎兒在影像學及病理檢查中被發(fā)現有其他系統病變：1例胎兒尸檢時發(fā)現存在明顯的多發(fā)皮膚白斑；5例胎兒在晚孕期胎兒頭部核磁檢查顯示出現室管膜下多發(fā)結節(jié)。

表3 38例胎兒心臟腫瘤TSC基因檢測結果 單位：例

3 討 論

橫紋肌瘤是胎兒期最常見的心臟腫瘤[10]，本研究也證實了這一點，尸檢胎兒中橫紋肌瘤占比為95%。胎兒的孕周對于胎兒心臟腫瘤的發(fā)現有較大的影響，本研究中超聲心動圖檢出心臟腫瘤的孕周中位數達27周，最小孕周為23周。在合適的孕齡，所有心臟腫瘤均能被FE檢出，主要使用切面為四腔心切面。對于高危家系，孕期FE篩查時間越早越好，但最佳檢測時間為孕中期，但對于直徑小于3 mm的腫瘤，超聲心動圖可能會出現漏診，對于可疑病例推薦有經驗的醫(yī)生連續(xù)多次掃查[11]?？傮w來說，權衡檢出率、病人接受度和經濟適用性等方面的因素，FE檢測是目前最適合的篩查方式。

心臟橫紋肌瘤的生長具有雙向性，在孕32周左右部分橫紋肌瘤開始出現退化的趨勢，并持續(xù)至出生后一年[5]。而引起心臟橫紋肌瘤出現自限性表現的主要因素就是腫瘤里的“蜘蛛樣細胞”，其并非真正的腫瘤細胞，而是富含糖原的異型心肌細胞，其不斷增大的糖原空泡會使細胞質絲退化，最終結局為凋亡、壞死和黏液樣變性[1]。腫瘤的退化與腫瘤的大小、數目及位置并沒有明顯的關系。約80%的心臟橫紋肌瘤會在兒童期退化直至自行消失[12]，因此，胎兒期是檢出心臟橫紋肌瘤的最佳時間段。本研究中大多數心臟腫瘤局限于心腔內，并且生長相對緩慢，僅有8例(21%)胎兒出現心臟并發(fā)癥，且沒有出現影響胎兒生命的嚴重并發(fā)癥。

胎兒心臟橫紋肌瘤在TSC的眾多臨床表現中，可能是其最早的表現之一[13]。因此，FE對于胎兒心臟橫紋肌瘤的識別具有重要的診斷意義，本研究中93%(27/29)的多發(fā)橫紋肌瘤胎兒基因檢測陽性，這也證實了多發(fā)的心臟橫紋肌瘤是TSC強有力預測因子[14]。而單發(fā)的心臟橫紋肌瘤情況則略有不同，既往的研究顯示約50%的單發(fā)橫紋肌瘤合并TSC[2]，但本研究中共有7例單發(fā)心臟橫紋肌瘤經病理證實，其中5例TSC1或TSC2基因檢測陽性，4例為新發(fā)突變，1例為家系遺傳突變。本研究結果顯示單發(fā)心臟橫紋肌瘤與TSC也有著較高的相關性，其原因可能是本研究依據病理結果進行統計，而不是僅僅根據FE，排除了非橫紋肌瘤病例的影響，但病例數較少，仍需增加病例進一步證實。

FE難以對非TSC的心臟橫紋肌瘤與合并TSC的心臟橫紋肌瘤進行鑒別，2012年國際TSC大會對TSC診斷標準進行了修訂，將基因診斷作為一個單獨診斷標準，因此，FE聯合基因診斷可將產前診斷TSC變?yōu)榭赡躘8]。TSC1基因和TSC2基因分別位于染色體9q34和16p13.3，分別參與編碼形成錯構瘤蛋白和馬鈴薯蛋白，形成TSC蛋白復合體，對雷帕霉素靶蛋白(mTOR1)信號通路起到關鍵的抑制調控作用[15]。常規(guī)外周血外顯子測序，約有85%的TSC病人檢測出明確的TSC1或TSC2致病突變[16]；通過改進檢測方法如增加測序深度等和增加樣本取材部位等，剩余病人中2/3能夠被檢測出非常規(guī)位置的TSC1或TSC2突變，包括內含子區(qū)域突變或嵌合體形成[17]。目前研究顯示沒有證據支持存在新的TSC致病基因[18]。因此，基因診斷對于TSC的臨床診斷是一個重要的補充，尤其是對于臨床表型不明顯的胎兒。

隨著對胎兒心臟病圍生期管理的關注以及多學科協作醫(yī)療模式的廣泛開展，越來越關注的不僅是產前胎兒心臟疾病的檢出，更多的是對每一種疾病給予正確的預后咨詢和圍生期管理。對于胎兒橫紋肌瘤而言，預后咨詢指導中不單純向孕婦及家屬介紹腫瘤本身的預后，還要注重交代橫紋肌瘤與TSC的關系及TSC的預后，并為可能的早期治療做好準備。