趙海 吳延軍 吳曙光 張健 姚剛

慢性疲勞綜合征（Chronic fatigue syndrome,CFS）是因生活節(jié)奏緊張而出現(xiàn)的一組以長(zhǎng)期疲勞為突出表現(xiàn)的全身性癥候群，又稱肌痛性腦脊髓炎（Myalgic encephalomyelitis，ME），主要表現(xiàn)為睡眠障礙，常伴有體重、運(yùn)動(dòng)能力下降、免疫功能受損及腸道菌群失調(diào)等臨床癥狀[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示CFS 危及我國(guó)人口的10%～25%，患者的線粒體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，ATP 能量生成降低[2，3]。研究表明神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、氧化應(yīng)激和遺傳因素等異?？烧T導(dǎo)CFS 的發(fā)生，懷孕期、更年期和月經(jīng)期等特殊時(shí)期會(huì)加重女性患者的臨床癥狀，同時(shí)妊娠女性胎盤提取物中的抗氧化、抗炎等生物活性物質(zhì)也顯著降低[4～6]。

哺乳動(dòng)物整個(gè)妊娠過程中子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲遷移、胎盤細(xì)胞增殖凋亡、絨毛膜尿囊融合以及母胎血管重建等過程在胎盤形成進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用，胎盤發(fā)育異常與子宮內(nèi)膜異位癥、子癇和妊娠高血壓等生殖性疾病息息相關(guān)[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)采用復(fù)合刺激法復(fù)制的慢性疲勞綜合征雌性鼠的血清中雌、孕激素水平和學(xué)習(xí)記憶功能顯著降低，下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂，且其學(xué)習(xí)記憶功能降低[8～10]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CFS 孕鼠胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)存在異常。研究表明細(xì)胞增殖和凋亡、氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)和FoxO 信號(hào)通路在胎盤的形成中起著重要作用[11～13]。CFS 孕鼠胎盤細(xì)胞增殖和凋亡情況、氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)和FoxO 信號(hào)通路因子表達(dá)是否存在異常，它們之間與CFS 孕鼠胎盤結(jié)構(gòu)異常是否有內(nèi)在關(guān)聯(lián)，目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過免疫組化、TUNEL 和比色法檢測(cè)正常和CFS 孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞增殖凋亡、氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)以及D13 胎盤細(xì)胞中FoxO 信號(hào)通路因子表達(dá)情況，初步探討CFS 孕鼠胎盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常與胎盤細(xì)胞增殖凋亡、氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)和FoxO 信號(hào)通路因子之間的關(guān)系，為闡明CFS 孕鼠胎盤結(jié)構(gòu)異常，F(xiàn)1 代出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的分子機(jī)制奠定一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑取SPF 級(jí)昆明小鼠，6～8 周齡，體重18.0～22.0g，共150 只，其中雌性100 只，雄性50只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（渝）2012-0001]。

兔源性PCNA（bs-2006R）、FoxO-1（bs-2537R）和FoxO-4（bs-2766R）多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1091）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；SP kit 兔源試劑盒（SP9001）、辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG（ZB2306）及DAB 顯色試劑盒（ZLI-9017）均購(gòu)自北京中衫金橋有限公司；伊紅染液（D019-1）和蘇木素染液（D005-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；氧化應(yīng)激指標(biāo)試劑盒活性氧（QY-X16254）、活性氮（QYY26312）和丙二醛（QY-Y23136），抗氧化應(yīng)激指標(biāo)試劑盒總抗氧化應(yīng)激能力（QY-Y61124）、過氧化氫酶（QY-Y32512）、超氧化物歧化酶（QY-S13521）、谷胱甘肽過氧化物酶（QY-T11542）和過氧化物酶（QY-X35410）購(gòu)自上海喬羽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及復(fù)制CFS 小鼠模型 將SPF 級(jí)100 只雌性小鼠隨機(jī)分為正常組（不給予任何處理，n=50）和CFS 組（給予復(fù)合刺激，n=50）。每組孕鼠受孕時(shí)間點(diǎn)各10 只，從獲取的每個(gè)時(shí)間位點(diǎn)組織中隨機(jī)抽取9 個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究。復(fù)合刺激包括實(shí)施束縛、力竭、夾尾、低溫、饑渴和明暗顛倒等處理，連續(xù)5 周，復(fù)制CFS 小鼠模型。

1.2.2 收集孕鼠血清、子宮及胎盤 CFS 小鼠模型復(fù)制成功后，采用摘除眼球法分別收集每組小鼠的血液，室溫靜置10min，離心，收集血清。此外脫臼處死每組小鼠各10 只，收集子宮。采用雄鼠與動(dòng)情期雌鼠1：2 合籠，次日早上9:00 觀察到陰栓者記為妊娠第1 天（記為D1），收集D8、D10、D12、D13 和D14 的胎盤組織，采用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定24h 后，經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋和切片。隨后采用IHC 和比色法進(jìn)行細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激和FoxO 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化 免疫組化步驟按北京中山金橋公司生產(chǎn)的SP 免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。孕鼠D8、D10、D12、D13 和D14 植入位點(diǎn)石蠟切片（5 μm），切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，枸櫞酸溶液抗原修復(fù)，山羊血清封閉，兔源性PCNA（1∶500 稀釋）、FoxO-1（1∶400稀釋）和FoxO-4（1∶400 稀釋）的多克隆抗體，4℃孵育過夜，次日分別加入山羊抗兔的二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（S-A/HRP）室溫孵育30min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞PCNA 的表達(dá)，以及D13 胎盤細(xì)胞中FoxO-1 和FoxO-4 的表達(dá)情況。

1.2.4 比色法 比色法檢測(cè)血清、子宮和孕鼠D13 胎盤組織中氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)含量，取出凍存的子宮和胎盤組織，采用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，過濾，收集濾液。將血清、子宮和胎盤的濾液分別加入96孔板內(nèi)，分別設(shè)為測(cè)試的樣品和空白組，每個(gè)孔重復(fù)3 次。隨后向空白每孔添加50μl 試劑SinoBestBio緩沖液A，向待測(cè)樣品孔內(nèi)分別加入50μl 試劑SinoBestBio 染色液B。輕輕搖動(dòng)96 孔板，使其混勻。放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里孵育30min，即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里，于580nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度值（OD），根據(jù)吸光度值構(gòu)建生成曲線，計(jì)算樣品實(shí)際濃度。

1.2.5 TUNEL 將D8、D10、D12 和D14 的石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟5～10min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10min。無水乙醇5min。90%乙醇2min，70%乙醇2min，蒸餾水2min，滴加20μg/ml 不含DNase的蛋白酶K（20mg/ml），用P0106 免疫染色洗滌液37℃作用20min，PBS 洗滌3 次。滴加50μl 的生物素標(biāo)記液（按照說明書進(jìn)行配制），37℃避光孵育60min。用PBS 洗滌1 次，滴加0.1～0.3ml 標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10min。用PBS 洗滌3 次，滴加0.5ml DAB 顯色液（按照說明書進(jìn)行配制DAB 顯色液），室溫孵育5～30min 或根據(jù)顯色情況孵育適當(dāng)時(shí)間。用PBS 洗滌3 次終止染色，隨后采用蘇木素染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。再用PBS 洗滌3 次，用梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明封片，顯微鏡下觀察孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 軟件，運(yùn)用單因素方差分析法（ANOVA）比較PCNA、FoxO-1、FoxO-4和TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞在不同組份胎盤中表達(dá)的差異性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFS 孕鼠胎盤細(xì)胞增殖情況免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胎盤細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較，CFS 組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤中增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，見圖1。Image Pro Plus圖像分析顯示，PCNA 在CFS 孕鼠D8 和D12 胎盤中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值與正常組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但PCNA 在D10 和D14 胎盤中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值顯著低于正常組（P＜0.05），見表1。

圖1 兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞增殖情況（×400）

表1 PCNA 在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞IOD 值比較（）

表1 PCNA 在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

2.2 CFS 孕鼠胎盤細(xì)胞凋亡情況采用TUNEL 法檢測(cè)胎盤細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，隨著妊娠天數(shù)的增加，CFS 組D8、D10、D12和D14 胎盤蛻膜區(qū)中細(xì)胞凋亡呈逐漸增加趨勢(shì)，見圖2。Image Pro Plus 圖像分析顯示，CFS 組孕鼠D8胎盤蛻膜區(qū)中陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的IOD 值與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），CFS 組D10、D12、D14 胎盤細(xì)胞蛻膜區(qū)中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），見表2。

表2 凋亡細(xì)胞在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤蛻膜區(qū)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞IOD 值比較（）

表2 凋亡細(xì)胞在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤蛻膜區(qū)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

圖2 兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞凋亡情況（×400）

2.3 CFS 孕鼠胎盤氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)受損采用比色法檢測(cè)兩組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFS組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應(yīng)激指標(biāo)活性氧、活性氮和丙二醛的含量均顯著高于正常組（P＜0.05）。CFS 組小鼠血清、子宮和孕鼠D13胎盤中抗氧化應(yīng)激指標(biāo)總抗氧化應(yīng)激能力、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶的含量均顯著低于正常組（P＜0.05），見表3。

2.4 CFS 孕鼠胎盤FoxO 信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FoxO 信號(hào)通路中指標(biāo)FoxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤迷路區(qū)中的表達(dá)均強(qiáng)于正常組，見圖3。Image Pro Plus 圖像分析顯示，F(xiàn)oxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），見表4。

表3 兩組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況

圖3 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤中的表達(dá)情況（×400）

表4 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值比較（）

表4 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

3 討論

慢性疲勞綜合征已成為21 世紀(jì)影響人類身心健康的新殺手，給患者的工作和家庭帶來很大困擾，在英國(guó)CFS 的發(fā)病率為0.19%，美國(guó)男性CFS發(fā)病率為2.3%，女性為1.9%，日本CFS 的發(fā)病率為1.5%，中國(guó)中學(xué)生的發(fā)病率為0.9%。CFS 與高壓力的生活狀態(tài)有關(guān)，隨著人們生活節(jié)奏的加快、生活壓力的增加，CFS 的發(fā)病率也越來越高，對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[14]。CFS 發(fā)病機(jī)制與病毒感染、能量代謝、大腦功能、精神心理因素、免疫系統(tǒng)功能、遺傳易感性和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等密切相關(guān)[15，16]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)女性患者的月經(jīng)不調(diào)、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔疼痛等婦科問題風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)和性功能障礙發(fā)病率明顯增高[17,18]。CFS 患者產(chǎn)科疾病的臨床表現(xiàn)和分子機(jī)制研究成為目前生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物胎盤不僅是母胎氣體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和胎兒代謝物排泄的場(chǎng)所，同時(shí)也是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。胎盤發(fā)育異常將導(dǎo)致自然流產(chǎn)、先兆子癇、宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation,IUGR）和葡萄胎等妊娠性疾病的發(fā)生發(fā)展[19，20]。研究表明胎盤的形成與氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)、FoxO、Tead 和Wnt等信號(hào)通路密切相關(guān)[21]。近年研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致多種疾病的主要因素，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)與子癇前期、妊娠高血壓及妊娠期糖尿?。℅DM）等妊娠特有疾病密切相關(guān)[22～24]。氧化應(yīng)激可加快胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡老化，進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的合體化、向浸潤(rùn)方向的分化和子宮螺旋動(dòng)脈重塑，加劇胎盤缺氧狀態(tài)形成的惡性循環(huán)，誘發(fā)病理妊娠[25]。氧化應(yīng)激可以通過增加促炎因子、線粒體損傷及下游基因表達(dá)參與胎盤細(xì)胞增殖凋亡、侵襲遷移和血管生成等進(jìn)程，致使胎盤功能障礙[26，27]。氧化應(yīng)激可造成人滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷，增殖和侵襲能力下降，致使胎盤發(fā)育異常[28]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）可能通過誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡參與子癇前期的發(fā)生[29]。

FoxO 屬于叉頭框蛋白（Forkhead proteins）家族，其成員包括FoxO-1、FoxO-3、FoxO-4 和FoxO-6，研究表明FoxO 家族信號(hào)參與轉(zhuǎn)錄、激活、抑制多個(gè)靶基因，參與調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、細(xì)胞周期、增殖凋亡、自噬、炎癥、氧化應(yīng)激、抑制腫瘤等[30～32]。研究表明FoxO-4、FoxO-1 和FoxO-3a 的過量表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖停滯，促進(jìn)凋亡[33]。此外FoxO 還參與胎盤的發(fā)育進(jìn)程，F(xiàn)oxO 是保護(hù)母胎免受氧化損傷的關(guān)鍵因子[34]。氧化應(yīng)激可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)因子影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移，從而參與胎盤的形成[35]。FoxO-3a 在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中起著關(guān)鍵作用，F(xiàn)oxO-1 可調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞JAR 的增殖和遷移，胎盤FoxO-1過度表達(dá)可能參與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展[36，37]。由此可見氧化應(yīng)激和FoxO 信號(hào)通路共同參與調(diào)控胎盤的形成。

本實(shí)驗(yàn)通過采用免疫組化和TUNEL 方法檢測(cè)不同妊娠時(shí)期CFS 孕鼠胎盤增殖和凋亡情況，同時(shí)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)和FoxO 信號(hào)因子的表達(dá)情況，探討CFS 孕鼠胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCNA 在CFS 孕鼠D8 和D12胎盤中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值與正常組無顯著性差異，但PCNA 在D10 和D14 胎盤迷路區(qū)中陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值顯著低于正常組（P＜0.05）。與此同時(shí)CFS組小鼠D10、D12 和D14 胎盤細(xì)胞蛻膜區(qū)中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），由此推測(cè)CFS 孕鼠胎盤增殖降低、凋亡增加可能致使胎盤結(jié)構(gòu)異常，但其具體的分子機(jī)制有待深入研究。

本研究采用比色法和免疫組化檢測(cè)兩組孕鼠D13 胎盤氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激指標(biāo)及FoxO 信號(hào)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFS 小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量均顯著高于正常組（P＜0.01）；CFS 小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中抗氧化應(yīng)激指標(biāo)含量均顯著低于正常組（P＜0.01）。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FoxO 信號(hào)通路中指標(biāo)FoxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤迷路區(qū)中的表達(dá)量均顯著高于正常組（P＜0.05）。據(jù)此，推測(cè)孕鼠FoxO 信號(hào)表達(dá)異常，胎盤抗氧化能力降低，致使胎盤增殖降低、凋亡增加，誘導(dǎo)胎盤結(jié)構(gòu)異常，最終導(dǎo)致CFS 孕鼠F1 代生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，本實(shí)驗(yàn)以期為CFS 女性患者的妊娠疾病治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。