韓春生 伍學強

流式細胞學技術在急性白血?。╝cute leukemia，AL）和骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）診斷中的作用日益突出。用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的變化，已成為AL 和MDS 診斷的基本標志，但是哪些抗原才是診斷不同類型白血病的最佳標志物，臨床工作者的意見尚不統(tǒng)一。AL 和MDS 的發(fā)病都是一些原本正常的細胞出現(xiàn)了分化紊亂，所以細胞表面抗原的變化有助于AL 和MDS的診斷。我們在臨床中發(fā)現(xiàn)CD56 在AL 和MDS 的診斷和預后判斷方面具有重要意義。

CD56 是一種粘附分子，又被稱為神經(jīng)細胞粘附分子，屬免疫球蛋白超家族成員,主要存在于自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）中，也可表達于T細胞亞群、單核細胞、漿細胞[1]；單核細胞異常表達CD56，常被認為與MDS、骨髓增殖性腫瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN）相關。漿細胞表達CD56有利于多發(fā)性骨髓瘤的診斷。CD56 可表達于包括AML、急性髓/NK 細胞白血病、急性淋巴性白血?。ˋLL）、淋巴瘤、骨髓瘤在內的多種血液系統(tǒng)腫瘤。CD56 表達與B-ALL 高風險中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤相關；與T-ALL 低完全緩解率相關[2]。在AML 中，特別是AML-M2 中CD56+被認為是預后較差的指標[3]。研究提示[4～6]，CD56+血液腫瘤預后不良，臨床療效差，預后差，易復發(fā)，總體生存期較短，易發(fā)生髓外浸潤。CD56 表達于MDS 和CMPN 的原始粒細胞、成熟粒細胞和單核細胞[7]。CD56 表達往往提示MDS 為高危MDS，預后較差，易于向AL 轉化。表達CD56 的血液系統(tǒng)腫瘤常被認為是具有高度侵襲性的惡性疾病[8]，所以有研究者建議初診時監(jiān)測CD56表達以判斷預后，并將CD56 作為監(jiān)測微小殘留病（minimal residual disease，MRD）的重要指標[9，10]。CD56+的AML 患者預后目前仍存在爭議[11]。我們用含有CD56 單抗的五色流式方案研究了142 例初診的AL 和MDS 的免疫表型患者以期發(fā)現(xiàn)CD56 在這些疾病中的表達規(guī)律，為臨床診斷和判斷預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2013 年9 月～2019 年9 月收治的142 例初診AL 和MDS 患者。依據(jù)臨床表現(xiàn)、流式免疫表型、骨髓形態(tài)學、細胞遺傳學、骨髓活檢進行確診。AL、MDS 均按照FAB 分型分類，MDS 根據(jù)骨髓原始細胞數(shù)量分成原始細胞增高組（RAEB-1、RAEB-2、CMML；骨髓原始細胞＞5%）和不增高組（RA、RAS；骨髓原始細胞＜5%）。其中AL 107 例，MDS 35 例；男69 例，女73 例，年齡2～82 歲。

1.2 材料應用貝克曼流式細胞儀（庫爾特Cytomics FC 500），胞內染色試劑和單克隆抗體購自美國BD 公司，抗原包括髓系、淋巴細胞系、巨核細胞系和紅細胞系的代表性抗原，具體包括CD2、cCD3、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD19、CD79a、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD45、CD56、CD61、CD64、CD71、CD117、HLA-DR、GlyA、MPO。

1.3 方法

1.3.1 標本制備嚴格按照流式樣本操作流程制備細胞懸液以備上機檢測。

1.3.2 流式檢測按照貝克曼（庫爾特Cytomics FC 500）流式細胞儀的操作手冊開機，用Cell Quest 軟件獲取數(shù)據(jù)，每管檢測100 000 個細胞，用CD45/側向散射光（SSC）設門收集骨髓單個核細胞。用Cell Quest 軟件分析檢測結果，以抗原表達量＞20%作為抗原表達陽性的界限。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組之間比較采用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD56 在AL 患者中表達情況用Cell Quest軟件分析檢測結果，在CD45/SSC 點圖上根據(jù)細胞CD45 和SSC 值將所研究細胞劃分為淋巴細胞群、單核細胞群、粒細胞群、CD45 弱表達群（主要為原始/幼稚細胞）、CD45 陰性表達細胞群（主要為有核細胞和細胞碎片）分別研究，進一步了解不同細胞群抗原表達情況。107 例AL 患者中1 例M1、34例M2、12 例M3、4 例M4、27 例M5、2 例M6、17 例B-ALL、10 例T-ALL。以CD56 細胞＞20%計為陽性，107 例AL 中有29 例（27.10%）的細胞群異常表達CD56。80 例AML 中有28 例表達CD56，陽性率為35.00%，27 例ALL 中有1 例表達CD56，陽性率為3.70%；CD56 在AML、ALL 中的表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.01，P＜0.05）。CD56 在AML 各亞型中的陽性率依次為：M2（52.94%）、M5（37.04%），M1、M3、M4、M6 未檢出CD56 表達，見表1。AL 中CD56 在原始細胞、粒細胞、單核細胞中的檢出率依次為75.86%、48.28%、13.79%。

表1 CD56 在AL 患者中的表達情況（n）

2.2 CD56 在MDS 中的表達情況在MDS 中CD56可異常表達于原始細胞（28.57%）、粒細胞（20.00%）、單核細胞（5.71%）。CD56 在原始細胞中表達比例最高。

35 例MDS 患者中原始細胞增高組的MDS 患者CD56 陽性率為54.55%,原始細胞不高組的MDS患者CD56 陽性率為53.85%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.05，P＞0.05）。原始細胞增高組和原始細胞不增高組：原始細胞CD56 陽性率為27.27%、30.77%，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.05，P＞0.05）；粒細胞CD56 陽性率為22.73%、15.38%,差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.28，P＞0.05）；單核細胞CD56 陽性率為4.55%、7.69%,兩組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.15，P＞0.05）。見表2。

表2 CD56 在MDS 中的表達情況（n）

2.3 AL 患者的染色體異常情況107 例AL 中檢出41 例存在染色體異常，染色體異常率約為38.32%。29 例CD56+的AL 患者19 例存在染色體異常；78例CD56-的AL 患者中檢出22 例存在染色體異常。在AL 患者中CD56+與CD56-的染色體異常檢出率為65.52%、28.21%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.45，P＜0.05）。29 例CD56+的AL 患者包括28 例AML和1 例T-ALL。28 例CD56+的AML 患者中可見到t（8;21）、-X、+8、t（9;22）、復雜核型、del（3-MLL）、+19 等細胞遺傳學改變，最常見的染色體異常是t（8;21）。即CD56+的AML 患者更易發(fā)生t（8;21）,多見于M2。見表3。

表3 28 例CD56+的 AML 患者染色體異常情況（n）

2.4 AL 患者中融合基因形成情況107 例AL 患者中檢出41 例存在融合基因，融合基因檢出率為38.32%。在29 例CD56+的AL 患者中檢出17 例存在融合基因，78 例CD56-的AL 患者中檢出24例存在融合基因，AL 患者中CD56+與CD56-融合基因檢出率為58.62%、30.77%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.94，P＜0.05）。28 例CD56+的AML 患者中可見到AML1/ETO、BCR/ABL、FLT3/ITD、WT1 等融合基因形成，AML1/ETO 融合基因在CD56+的AML 患者中的檢出率最高，為50.00%；主要見于AML-M2。即CD56+的AL 患者更易形成AML1/ETO 融合基因,多見于M2。見表4。

表4 28 例CD56+的AML 患者融合基因形成情況（n）

2.5 MDS 患者的染色體情況35 例MDS 患者中檢測出存在5q-、-7、20q-、+3q、+8、+18、+mar、t（13；21）、復雜核型（3 種及以上異常核型）等染色體異常，染色體異常檢出率為60.00%。CD56+的MDS患者中11 例存在染色體異常，IPSS 平均積分為8分。CD56-的MDS 患者中10 例存在染色體異常，IPSS 平均積分為5 分。CD56+的MDS 與CD56-的MDS 染色體異常檢出率為64.71%、55.56%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.31，P＞0.05）。影響預后的積分CD56+的MDS 患者高于CD56-的MDS 患者。見表5。

表5 35 例MDS 患者染色體情況（n）

3 討論

我們用流式細胞儀檢測了107 例急性白血病和35 例MDS 患者骨髓單個核細胞CD56 的表達情況，流式檢測的優(yōu)勢在于可以同時用不同的抗體確定這些疾病中的不同細胞群,從而確定CD56 在不同細胞群上的表達情況。本研究發(fā)現(xiàn)107 例急性白血病患者中有29 例CD56 表達陽性（＞20%）。CD56在AML-M2、AML-M5、T-ALL 的白血病細胞上均有不同程度表達，而CD56 更常表達于AML，且CD56在AML-M2 中的表達比其他類型急性白血病高。CD56 是區(qū)別AML 和ALL 的標志之一。文獻報道[3]CD56 在AML 中的檢出率為13%～29%，其中主要在AML-M2、AML-M3、AML-M5、AML-M7 中 檢 出CD56 陽性表達。本研究CD56 檢出率較國外報道稍高。有報道[12]稱CD56+的AML-M3 患者，多伴隨t（11；17），也可見t（15；17）。CD56+的AML-M3 患者盡管總體存活期無顯著差異,但緩解持續(xù)時間和無病生存期更短，預后、療效更差[13]。本研究未檢出M3 表達CD56，可能與樣本量有限有關。

MDS 是一種以一系或多系病態(tài)造血為特征的髓系腫瘤，具有向AL 轉化的高風險。免疫分型在MDS 診斷和預后判斷中的作用逐漸被人們所肯定。CD56 在MDS 診斷、疾病進展、預后判斷中的作用也不斷被認可。MDS 診斷目前仍屬于排他性診斷，診斷MDS 尚無明確手段。流式細胞學是診斷MDS 的重要輔助性方法。選擇何種抗原來診斷MDS 及判定預后成為亟待解決的問題。相關研究提示CD56在診斷MDS 及判斷預后方面具有重要參考價值。我們用流式檢測的方法更直觀地證明了CD56 可做為AL 和MDS 的惡性細胞分化的標志。

CD56 異常表達常伴隨染色體和/或融合基因形成。即CD56 可預測融合基因和染色體情況。在AML 中CD56+多伴隨有t（8；21）和/或AML1/ETO融合基因形成。本研究MDS 染色體異常檢出率為60.00%，與文獻報道的40%～70%基本一致[10]，但是影響預后的積分，CD56+的MDS 患者高于CD56-的MDS 患者，CD56+的MDS 患者預后更差。Hu 等[14]報道盡管CD56 表達對無病存活率、總生存期無顯著影響，但是CD56+的AML 患者完全緩解率更低。我們發(fā)現(xiàn)CD56 異常表達時多存在細胞遺傳學及分子生物學的異常。檢測CD56 表達情況可能有利于疾病的療效觀察、疾病分層治療及預后判定。

在AL 和MDS 中CD56 常表達于原始細胞（早期階段細胞）。由于CD56 被廣泛認為是惡性、具有侵襲性的標志，所以在高度增殖的所有系列來源的異常細胞上均應表達，但是CD56 似乎更常表達于原始細胞，其次為粒細胞、單核細胞。該現(xiàn)象我們在AL 和MDS 病例中均有發(fā)現(xiàn)。在AL、MDS 中異常表達CD56 的原始細胞檢出率分別為75.86%、28.57%，均高于成熟粒細胞、單核細胞。CD56+更常表達于原始細胞，可能與AL、MDS 中的原始細胞似乎更易發(fā)生惡變有關，MDS 中CD56 表達與原始細胞是否增高有關，具體機制有待繼續(xù)研究。

綜上所述，我們認為CD56 作為診斷AML 和MDS 的重要標志，可用于預后判斷，但在實際應用中仍需進一步研究。