葉玲 洪苓苓

肺隱球菌?。≒ulmonary cryptococosis，PC）是一種由隱球菌感染引起的急性或亞急性肺部真菌病，隱球菌主要經(jīng)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)，肺是隱球菌感染的首發(fā)部位，中樞神經(jīng)系統(tǒng)最易受累，是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)感染性疾病，好發(fā)于免疫功能低下者，但在免疫力正常的患者中，若合并相關(guān)易感因素者也可出現(xiàn)[1，2]。研究報(bào)道顯示，肺隱球菌病患者的臨床表現(xiàn)可以無(wú)癥狀，也可以表現(xiàn)為致死性的感染[3]。而在影像學(xué)上，PC 可因免疫功能的差異出現(xiàn)各種影像學(xué)表現(xiàn)，以肺部單發(fā)或多發(fā)的周圍型的結(jié)節(jié)團(tuán)塊及局限的肺炎樣病灶最為多見(jiàn)，約占66%，其次還可表現(xiàn)為彌漫的、播散的肺炎樣浸潤(rùn)和實(shí)變，可形成空洞和暈征，亦可表現(xiàn)為網(wǎng)格狀浸潤(rùn)、肺門(mén)縱隔淋巴結(jié)腫大、胸腔積液、彌漫性粟粒影及磨玻璃樣滲出等[4]。

隱球菌抗原檢測(cè)是診斷PC 的一種無(wú)創(chuàng)、快速、有效的實(shí)驗(yàn)方法，其次為病原學(xué)檢查，可常規(guī)行支氣管鏡下毛刷及BALF 直接鏡檢或培養(yǎng)，但陽(yáng)性率不高，因此，組織病理學(xué)檢查是確診肺隱球菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其病理改變?yōu)榈湫腿庋磕[性病變（非干酪樣），通過(guò)特殊染色（墨汁染色、PAS 染色、六胺銀染色等）可明顯提高隱球菌的檢出率。

快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)（rapid on-site evaluation，ROSE）是目前呼吸介入病學(xué)中不可缺少的一部分，它可以在支氣管鏡檢查、肺穿刺等介入操作過(guò)程中由細(xì)胞或微生物病理學(xué)專業(yè)人員對(duì)穿刺標(biāo)本進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)制片和染色并快速評(píng)價(jià)，向操作者反饋穿刺是否成功，減少不必要的穿刺，提供初步診斷[5，6]。ROSE技術(shù)包括快速現(xiàn)場(chǎng)細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)（C-ROSE）和快速現(xiàn)場(chǎng)微生物學(xué)評(píng)價(jià)（M-ROSE），臨床上C-ROSE 應(yīng)用范圍更廣，M-ROSE 則更多地應(yīng)用于真菌感染疾病的診斷，由于微生物大多需要特殊染色，臨床上確診時(shí)間被拉長(zhǎng)，而M-ROSE 則通過(guò)其獨(dú)有的實(shí)時(shí)性及高準(zhǔn)確性在肺部特殊感染的診斷中具有優(yōu)勢(shì)，本研究通過(guò)對(duì)比我院近2 年肺隱球菌病患者的診治過(guò)程，探討M-ROSE 聯(lián)合肺活檢對(duì)疑診肺隱球菌病的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析我院近2 年收治的經(jīng)病理確診為肺隱球菌病的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前已行胸部CT 平掃+增強(qiáng)顯示肺部單發(fā)或多發(fā)的結(jié)節(jié)團(tuán)塊影或肺炎樣病灶，但經(jīng)正規(guī)抗感染治療無(wú)效；②綜合分析患者的病史、輔助檢查結(jié)果后高度懷疑肺隱球菌病；③術(shù)前完善檢查，排除肺活檢相關(guān)禁忌證；④術(shù)前告知患者及家屬操作過(guò)程及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在凝血功能障礙、嚴(yán)重心、肺功能衰竭等手術(shù)禁忌證；②不能獲取完整臨床資料者。共收集4 例肺隱球菌病患者，其中男1 例，女3 例，年齡26～53 歲，平均42.2歲。其中，慢性乙型肝炎1 例，精神分裂癥1 例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1 例，無(wú)基礎(chǔ)疾病1 例。肺部影像學(xué)多表現(xiàn)為多發(fā)結(jié)節(jié)或肺炎樣病變（見(jiàn)圖1）。所有病例結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測(cè)均陰性，隱球菌莢膜抗原陽(yáng)性3 例，陰性1 例，所有患者均已行M-ROSE 且最終均經(jīng)病理確診。

1.2 研究方法

1.2.1 CT 引導(dǎo)下肺穿刺過(guò)程 術(shù)前常規(guī)鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，監(jiān)測(cè)生命體征，閱片評(píng)估，定位后CT 引導(dǎo)，18G 半自動(dòng)活檢針、同軸引導(dǎo)活檢針穿刺切割獲取病變組織，呼吸科醫(yī)師現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行制片、染色及快速評(píng)價(jià)，隨后將幾乎無(wú)損失的剩余組織固定后送檢病理，穿刺結(jié)束后記錄ROSE 判讀結(jié)果所需時(shí)間。

1.2.2 M-ROSE 過(guò)程 取材后由經(jīng)正規(guī)培訓(xùn)后的呼吸科醫(yī)師現(xiàn)場(chǎng)制片：取材后組織滾片，迪夫快速染色（A 液20s，B 液30s），顯微鏡下根據(jù)細(xì)胞學(xué)特征行快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估，若M-ROSE 結(jié)果為陽(yáng)性則繼續(xù)原位取材，若M-ROSE 結(jié)果為陰性則調(diào)整后再次取材，記錄當(dāng)時(shí)M-ROSE 陽(yáng)性結(jié)果的判讀時(shí)間?，F(xiàn)場(chǎng)閱片結(jié)果判定標(biāo)本滿意，記錄ROSE 診斷結(jié)果及具體時(shí)間，結(jié)束操作（見(jiàn)圖2）。

1.3 診斷結(jié)果的判讀以CT 引導(dǎo)下肺穿刺術(shù)后送檢的組織標(biāo)本所獲得明確的病理結(jié)果為最終診斷，本研究中病例標(biāo)本的病理PAS 染色后均可見(jiàn)隱球菌孢子，可以明確診斷肺隱球菌?。ㄒ?jiàn)圖3）。

圖1 4 例肺隱球菌病患者的胸部CT 表現(xiàn)，其中有空洞、結(jié)節(jié)、實(shí)變影等表現(xiàn)

圖2 肺隱球菌病的ROSE 表現(xiàn)（×200，箭頭所示為隱球菌孢子）

圖3 肺隱球菌病的病理表現(xiàn)（×400，箭頭所示為隱球菌孢子）

1.4 穿刺標(biāo)本合格性判斷若某一標(biāo)本在鏡下可見(jiàn)明顯特殊細(xì)胞，則認(rèn)為該穿刺標(biāo)本合格；若患者的組織學(xué)標(biāo)本見(jiàn)大量紅細(xì)胞、壞死細(xì)胞、呼吸道粘膜細(xì)胞，則認(rèn)為該穿刺標(biāo)本不合格。隱球菌快速迪夫染色（Diff-quik stain）后鏡下可見(jiàn)菌體，圓形或橢圓形，直徑5～25μm，鏡下似空泡，有厚壁莢膜，莢膜可比菌體大1～3 倍，亦可見(jiàn)芽生孢子[7]。菌體和孢子多存在于肉芽腫和巨噬細(xì)胞中（見(jiàn)圖2）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 診斷準(zhǔn)確性所有患者肺穿刺術(shù)后的病理學(xué)結(jié)果即為患者的最終診斷，現(xiàn)場(chǎng)M-ROSE 的報(bào)告與病理結(jié)果的符合率為100%，ROSE 對(duì)肺隱球菌病的診斷敏感度為100%。目前暫無(wú)陰性結(jié)果。

2.2 診斷實(shí)時(shí)性4 例肺隱球菌病患者ROSE 口頭判讀時(shí)間為5min、9min、6min、9min，平均時(shí)間為7.25min，出具報(bào)告的時(shí)間為30min、50min、33min、58min，平均為42.75min，病理結(jié)果最終報(bào)告的時(shí)間為取材后78h、72h、72h、88h，除去外送病例的病理結(jié)果時(shí)間，平均病理報(bào)告時(shí)間需要77.33h，兩組之間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-14.283，P＜0.05）。

2.3 并發(fā)癥的比較CT 引導(dǎo)下肺活檢術(shù)已基本成熟，常見(jiàn)的并發(fā)癥多為咯血、氣胸、縱隔氣腫、心律失常、低血壓、發(fā)熱等，本研究的患者均無(wú)明顯并發(fā)癥。

3 討論

近年來(lái)，由于抗生素、激素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物的大量使用導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷，所以PC 患者已逐年增加，但也有報(bào)道稱 50% 的 PC 患者可以為免疫功能正常的人群，且臨床表現(xiàn)輕微，也是導(dǎo)致臨床上PC 診斷困難的重要因素[8]。病理結(jié)果已成為PC 的確診依據(jù)，而在早期或者高度疑似病例，隱球菌抗原檢測(cè)（膠體金免疫層析法）可作為篩查，其中膠體金免疫層析法比乳膠凝集法和酶聯(lián)免疫法具有更高的準(zhǔn)確性，其敏感性和特異性可達(dá)91.67%和99.61%，且在室溫下穩(wěn)定，10min 即可出結(jié)果[9]，本研究中ROSE 口頭報(bào)告平均時(shí)間為7.25min，且與病理結(jié)果的符合率達(dá)100%，由于樣本量較少，二者之間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尚需進(jìn)一步研究。

隨著呼吸介入及快速染色技術(shù)的崛起，快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)技術(shù)的價(jià)值與優(yōu)勢(shì)越來(lái)越突出，已經(jīng)逐漸滲透到臨床中并廣受歡迎，尤其是對(duì)介入呼吸病學(xué)的診斷方面[10,11]。ROSE 主要包括制片、染色和閱片三個(gè)步驟，研究表明，通過(guò)短期學(xué)習(xí)，普通臨床、醫(yī)技工作者都可掌握ROSE 的快速制片染色方法，但ROSE 的閱片判讀才是現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估的重點(diǎn)。在國(guó)外，曾有報(bào)道由生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家?guī)椭凶xROSE 結(jié)果，但因其成本較高而無(wú)法推廣，目前處于嘗試階段[12]。2014 年Chest 雜志發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，肺科醫(yī)師經(jīng)過(guò)3 個(gè)月的細(xì)胞病理學(xué)知識(shí)培訓(xùn)后，進(jìn)行ROSE 判讀，準(zhǔn)確率達(dá)80%，與細(xì)胞病理學(xué)家92%的準(zhǔn)確率相比，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[13]。在國(guó)內(nèi)，由馮靖教授及其團(tuán)隊(duì)對(duì)呼吸介入ROSE 的開(kāi)展和推廣起到極其重要的作用，其中的成人C-ROSE 與術(shù)后病理診斷符合率近100%，M-ROSE 中結(jié)核病與病理診斷符合率約70%，真菌感染臨床符合率超過(guò)90%[14～16]。本研究結(jié)果表明ROSE 報(bào)告及最終病理結(jié)果的一致率達(dá)到了100%，而且ROSE 可明顯縮短肺隱球菌病的診斷時(shí)間，能盡早開(kāi)始抗真菌治療，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，值得臨床推廣。

目前，對(duì)于M-ROSE 可進(jìn)行的染色方式有[17]：①迪夫快速染色：它是在瑞氏染色基礎(chǔ)上加以改良所形成的一種極快速染色方式，耗時(shí)僅50s，多數(shù)情況下1min 內(nèi)就可以在顯微鏡下觀察。這種染色通常用于絕大多數(shù)C-ROSE 與M-ROSE，是ROSE 最常用的染色方式，也是現(xiàn)階段WHO 唯一推薦的標(biāo)準(zhǔn)ROSE 染色方法[18]。②極快速改良乳酸染色，主要應(yīng)用于各類真菌。③快速支原體 DNA 霍氏熒光染色，主要應(yīng)用于支原體感染。④快速金-羅耐酸菌熒光染色，主要應(yīng)用于抗酸菌如結(jié)核分枝桿菌、奴卡菌、軍團(tuán)菌。⑤試劑盒化快速革蘭染色，主要應(yīng)用于球菌和桿菌。

M-ROSE 的優(yōu)勢(shì)不僅體現(xiàn)在微生物形態(tài)學(xué)方面，還可以提供明確的細(xì)胞學(xué)背景。研究表明，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是機(jī)體對(duì)抗肺部細(xì)菌感染的主要防御機(jī)制，因此，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞吞噬細(xì)菌現(xiàn)象對(duì)感染性疾病的微生物病原有明確的提示意義[16]。采用 BALF 快速制片結(jié)合M-ROSE 在中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌方面可以獲得較高的陽(yáng)性率，這也提示了M-ROSE在呼吸介入病學(xué)應(yīng)用中的重要地位[13]。

綜上所述，本研究通過(guò)總結(jié)分析4 例肺隱球菌患者的診斷和治療經(jīng)過(guò)，表明ROSE 技術(shù)在肺隱球菌病理診斷中具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)于隱球菌莢膜抗原的檢測(cè)，臨床意義重大。本研究仍存在不足，由于我科ROSE 技術(shù)開(kāi)展尚早，病例樣本量不大，需繼續(xù)收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)一步證明ROSE快速診斷的優(yōu)勢(shì)，此外，由于醫(yī)院條件及設(shè)備的限制，現(xiàn)場(chǎng)制片及染色之間存在一定的時(shí)間浪費(fèi)，導(dǎo)致ROSE 報(bào)告時(shí)間延長(zhǎng)，有望進(jìn)一步縮短報(bào)告出具時(shí)間，上述兩點(diǎn)不足之處需要更多的實(shí)踐進(jìn)一步探討及改進(jìn)。