呂雪幼，周玉平，楊萍，朱林文

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 寧波 315020；2.寧波大學(xué) 消化疾病研究所，浙江 寧波 315020；3.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，浙江 寧波 315100；4.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，浙江 寧波 315211）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）研究領(lǐng)域的最新熱點(diǎn)之一，在闡明疾病發(fā)病機(jī)制及相關(guān)的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面，取得了重大進(jìn)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA與原發(fā)性肝癌、脂肪肝等多種慢性肝病有關(guān)，部分學(xué)者也初步探討了其與肝纖維化的關(guān)系[2-3]。 本課題組通過基因芯片技術(shù)初步分析了肝纖維化模型小鼠肝臟的circRNA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)mmu_circ_42398的表達(dá)變化差異最大，模型組與正常組表達(dá)量相差11.74倍[4]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證mmu_circ_42398在肝纖維化模型肝組織和相關(guān)的細(xì)胞模型的表達(dá)變化，并初步探討其功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：C57BL/6雄性小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)獲得寧波大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。AML12細(xì)胞株、RAW264.7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；JS1細(xì)胞株購自深圳豪地華拓生物公司。

1.1.2 主要試劑和儀器：CCl4分析純及3% H2O2

購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒購自武漢USCN公司。重組TGF-β1細(xì)胞因子購自南京金斯瑞生物科技公司。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）購自北京索萊寶科技有限公司。RNAhold液購自北京全式金生物公司。TRIzol試劑購自美國 Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix購自美國Promega公司。α-SMA、collagen I（ColI）、GAPDH蛋白一抗購自美國Proteintech公司。mmu_circ_42398過表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒由廣州吉賽生物科技公司構(gòu)建。 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen公司。Agilent-Mx3005P實(shí)時熒光定量PCR儀為美國安捷倫公司產(chǎn)品。PCR小鼠引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR所用引物序列

1.2 方法

1.2.1 動物造模和標(biāo)本取材：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d， 隨機(jī)分為正常組、模型組，每組8只。模型組按體質(zhì)量以15% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，正常組不處理。5周末采集小鼠肝臟，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，下腔靜脈采血，切取肝臟最大葉放入4%多聚甲醛固定用于石蠟切片；其余肝組織液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織病理學(xué)觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥和膠原增生情況。組織切片由2位病理專家盲法進(jìn)行閱片。

1.2.3 復(fù)制肝星狀細(xì)胞活化模型：培養(yǎng)JS1細(xì)胞至對數(shù)生長期細(xì)胞，鋪6孔板，每孔1.5×105個細(xì)胞，完全培養(yǎng)基（含10% FBS）培養(yǎng)24 h后，換成無血清DMEM饑餓培養(yǎng)細(xì)胞12 h，再給予5 ng/mL（DMEM稀釋）TGF-β1刺激細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 復(fù)制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型：培養(yǎng)AML12細(xì)胞至對數(shù)生長期，鋪6孔板，每孔3×105個細(xì)胞，完全培養(yǎng)基DMEM+F12（1:1）培養(yǎng)24 h后，換成無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞12 h，添加H2O2孵育（終濃度為250 μmol/L）、12 h，收集細(xì)胞上清液采用試 劑盒檢測ALT、AST、SOD，收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 復(fù)制巨噬細(xì)胞炎癥激活模型：培養(yǎng)RAW.264.7 細(xì)胞至對數(shù)生長期，鋪6孔板，每孔1.5×105個細(xì)胞，完全培養(yǎng)基（含10% FBS1640培養(yǎng)基）培養(yǎng)24 h后，換成無血清DMEM饑餓培養(yǎng)12 h，再給予100 ng/mL（DMEM稀釋）LPS刺激12 h，收取培養(yǎng)液用ELISA試劑盒檢測TNF-α含量，收集細(xì)胞行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析：在目標(biāo)序列上使用最新miRBase中的microRNA信息進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，根據(jù)與目標(biāo)序列上MRE的microRNA覆蓋度以及整合其他信息（mRNA/microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)），選擇適當(dāng)?shù)倪^濾閾值（一般為site coverage≥0.3），得到符合要求的CeRNA關(guān)系對。采用Cytoscape軟件繪制CeRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，以說明circRNA-miRNA-mRNA的關(guān)系。

1.2.7 qPCR：TRIzol法提取總RNA，將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（20 μL體積），5倍稀釋后-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，條件設(shè)置為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；40個PCR循環(huán)（95 ℃變性10 s， 60 ℃退火60 s）。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 Western blot：提取JS1細(xì)胞蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，洗膜，5%BSA/PBS封閉1 h，加一抗（α-SMA、ColI及GAPDH），4 ℃輕搖孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫孵育1 h。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影，獲取條帶后Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。每次設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建pLC5- mmu_circ_42398過表達(dá)質(zhì)粒載體，JS1細(xì)胞分為mmu_circ_42398組、陰性對照組（vector組）和control組，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，將過表達(dá)載體或?qū)φ湛蛰d體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測 mmu_circ_42398表達(dá)情況。同時設(shè)計(jì)測序引物（F：5’-CCTGAGTTCTTCAAGTCTGCTC-3’；R：5’-CCAGCTCCA TTAGCACCTGGAAG-3’），PCR后回收條帶測序驗(yàn)證環(huán)化位點(diǎn)接頭。另提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測細(xì)胞α-SMA、ColI蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，2組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化模型小鼠肝組織病理學(xué)及mmu_circ_42398的表達(dá)變化 HE染色和Masson染色顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞廣泛壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，肝組織膠原廣泛增生，由匯管區(qū)向四周放射延伸，部分形成大小不一的完整假小葉結(jié)構(gòu)，肝纖維化模型制備成功（見圖1A-B）。qPCR結(jié)果顯示，模型組肝組織mmu_circ_42398表達(dá)顯著低于正常組（P＜0.05）（見圖1C）。

2.2 mmu_circ_42398在肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞模型中的表達(dá)變化 qPCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激JS1細(xì)胞后α-SMA、ColI mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01），提示JS1細(xì)胞活化模型復(fù)制成功；qPCR結(jié)果顯示，相比對照組，模型組mmu_circ_42398表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（見圖2A）。生化試劑盒檢測結(jié)果顯示， 250 μmol/L的H2O2刺激AML12細(xì)胞12 h后ALT、AST酶活性顯著升高（P＜0.05），提示肝細(xì)胞氧化應(yīng)激模型復(fù)制成功；qPCR結(jié)果顯示，相比對照組，模型組circRNA_42398表達(dá)顯著降低（P＜0.01）（見圖2B）。ELISA檢測結(jié)果顯示，100 ng LPS刺激RAW264.7細(xì)胞12 h后細(xì)胞上清中TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），提示細(xì)胞炎癥損傷模型復(fù)制成功；qPCR結(jié)果顯示，相比對照組，模型組mmu_circ_42398表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（見圖2C）。

圖2 mmu_circ_42398及炎性指標(biāo)在肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞模型中的表達(dá)變化

2.3 mmu_circ_42398靶基因的生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，得到mmu_circ_42398作用的靶基因，同時利用cytoscape軟件建立 circRNA靶基因參與的信號通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，粉紅色代表其可能結(jié)合的miRNA，黃色代表靶miRNA可能結(jié)合的mRNA，見圖3。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索及分析發(fā)現(xiàn)，mmu_circ_42398的靶基因miR-338-3p可能和肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化相關(guān)信號通路有關(guān)，從而影響肝纖維化進(jìn)展。

2.4 mmu_circ_42398過表達(dá)對JS1細(xì)胞活化的影響 qPCR檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)組mmu_circ_42398的基因表達(dá)較vector增加幾百萬倍（P＜0.01）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測序，確定其環(huán)化位點(diǎn)，并將其序列信息與數(shù)據(jù)庫circbase中的序列信息對比，結(jié)果是一致的，證明該cicrRNA確實(shí)為環(huán)狀RNA，而非線性RNA結(jié)構(gòu)。qPCR結(jié)果顯示，mmu_circ_42398過表達(dá)的JS1細(xì)胞α-SMA及ColI的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。見圖4。

3 討論

圖3 mmu_circ_42398靶基因參與的信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

近幾年circRNA研究取得了較大進(jìn)展，其與肝臟疾病的關(guān)系也逐漸被揭示，但目前的研究主要聚焦在肝癌、脂肪肝等領(lǐng)域，與肝纖維化關(guān)系的研究報(bào)道不多[2-3]。2017年CHEN等[5]首次報(bào)道了circRNA 與HSC活化有關(guān)，采用芯片技術(shù)分析了放射線誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化模型的circRNA差異表達(dá)譜，并進(jìn)一步證實(shí)了hsa_circ_0071410可通過“miRNA海綿作用”結(jié)合miR-9-5p，從而影響HSCs的活化；WANG等[6]發(fā)現(xiàn)患者血清CircMTO1表達(dá)水平與肝纖維化疾病進(jìn)展顯著負(fù)相關(guān)，通過體外HSC細(xì)胞活化模型進(jìn)一步證實(shí)了CircMTO1可通過結(jié)合miR-17-5p，提高Smad7的表達(dá)水平，從而抑制肝纖維化進(jìn)展；另外，ZHU等[7]的研究發(fā)現(xiàn)circRNA-0067835可通過調(diào)節(jié)miR-155/FoxO3信號通路影響HSC的活化。上述幾項(xiàng)研究表明，部分circRNA可影響HSC活化這一肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞生物學(xué)事件，但circRNA與肝纖維化的關(guān)系仍有待進(jìn)一步探究。

本課題組圍繞circRNA與肝纖維化的關(guān)系也開展了探索性研究，通過基因芯片技術(shù)篩選出了肝纖維化模型肝組織中差異表達(dá)的circRNA譜，其中變化差異最大的為mmu_circ_42398[4]。本研究在既往工作基礎(chǔ)上，采用qPCR驗(yàn)證了mmu_circ_42398在動物模型組織水平表達(dá)顯著低于對照組，與前期芯片結(jié)果是一致的。為了探討mmu_circ_42398在肝纖維化進(jìn)展細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制中的作用，復(fù)制了肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、巨噬細(xì)胞炎癥、HSC活化肝纖維化相關(guān)的3種細(xì)胞模型，然后檢測了mmu_circ_42398在其中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示其在3種細(xì)胞模型中均表達(dá)降低。接著，我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測其生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)可能與HSC活化相關(guān)的信號通路有關(guān)。mmu_circ_42398具有miR-344-3p的miRNA的反應(yīng)元件（microRNA response element，MRE），能靶向與之結(jié)合，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游mRNA的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。既往有研究發(fā)現(xiàn)，miR-344具有激活Wnt/β-catenin信號通路作用[8]，而經(jīng)典Wnt信號通路在HSCs活化中非常重要，激活β-catenin將促進(jìn)HSCs的活化[9]，這提示miR-344可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)HSCs的活化。推測mmu_circ_42398可能調(diào)控miR-344/Wnt/β-catenin信號通路抑制HSCs的活化。

圖4 mmu_circ_42398過表達(dá)對JS1細(xì)胞活化的影響

為了證實(shí)這一推測，我們構(gòu)建了mmu_circ_ 42398過表達(dá)質(zhì)粒載體，并將其轉(zhuǎn)染到JS1細(xì)胞中，觀察了HSC活檢標(biāo)志物α-SMA蛋白表達(dá)及ColI膠原產(chǎn)生的情況，結(jié)果證實(shí)mmu_circ_42398過表達(dá)能顯著抑制HSC的活化。本研究通過深入研究circRNA與肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系，有助于推進(jìn)肝纖維發(fā)病機(jī)制的研究及其有關(guān)治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。本研究的不足之處為尚未通過熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)明確mmu_circ_42398與其靶基因miR-338-3p的直接作用及其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，其具體的分子機(jī)制尚不清楚，這些是未來課題組要開展的工作。