秦維超，孫貴銀，李 峰，袁 進(jìn)，張運(yùn)洪，鄒靜波，陳 文

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.院長(zhǎng)辦公室；3.感染科，重慶 402260；4.重慶市永川區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 402160；5.重慶市江津區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 402260)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種急性感染性肺炎，是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起，可對(duì)公民生命健康造成嚴(yán)重危害的傳染性疾病[1-3]。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)SARS-CoV-2核酸，開(kāi)放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白N基因是主要的檢測(cè)靶點(diǎn)[4]。COVID-19患者咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、外周血、糞便等標(biāo)本可用于檢測(cè)SARS-CoV-2核酸[5]。其中，檢測(cè)出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性是臨床確診COVID-19的依據(jù)，連續(xù)兩次病毒核酸檢測(cè)陰性是患者出院的標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。病毒核酸檢測(cè)具有快速、早期、靈敏、特異等優(yōu)勢(shì)，但檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到標(biāo)本類型與質(zhì)量、設(shè)備試劑性能、實(shí)驗(yàn)操作以及不同疾病階段等因素影響[7]。

SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性是COVID-19病例確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]，而核酸檢測(cè)方法由于受采樣部位、采樣手法等多種因素的影響，也出現(xiàn)了一些假陰性的結(jié)果。隨著疫情的逐步控制，治愈出院患者也逐步增多，與此同時(shí)，也出現(xiàn)了出院患者復(fù)檢SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性的報(bào)道。LAN等[9]報(bào)道了武漢大學(xué)中南醫(yī)院COVID-19患者出院后核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)病例。重慶地區(qū)也出現(xiàn)了少數(shù)上述情況。本文回顧性分析了江津區(qū)中心醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“本院”)3例COVID-19患者在疾病初期確診、治療出院和轉(zhuǎn)診隔離過(guò)程中，3家醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)結(jié)果情況及診療轉(zhuǎn)歸流程，分析患者體內(nèi)SARS-CoV-2排出時(shí)間，探討核酸檢測(cè)假陰性影響因素和疾病治療過(guò)程中SARS-CoV-2排出時(shí)間使出院患者核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)的可能原因。

1 病例資料

病例1，男，68歲。旅居史：2020年1月22日從湖北回重慶。發(fā)?。?1月31日，患者無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱于本院就診。確診治療：2月4日江津區(qū)疾病預(yù)防控制中心(以下簡(jiǎn)稱“疾控中心”)檢測(cè)咽拭子SARS-CoV-2核酸結(jié)果為陽(yáng)性，診斷為COVID-19普通型；2月5日轉(zhuǎn)入重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“定點(diǎn)醫(yī)院”)進(jìn)一步隔離治療，采用干擾素a-2b注射液霧化，阿比朵爾、克力芝、中藥制劑抗病毒治療。出院：經(jīng)治療后患者連續(xù)11 d無(wú)發(fā)熱，2月15、16日連續(xù)兩次(間隔24 h)核酸檢測(cè)陰性，經(jīng)專家會(huì)診，符合出院患者標(biāo)準(zhǔn)出院。轉(zhuǎn)診隔離：2月17日出院后轉(zhuǎn)入本院隔離病區(qū)進(jìn)行醫(yī)學(xué)隔離觀察、治療。復(fù)陽(yáng)：2月18日，本院取患者咽拭子進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性，19日咽拭子病毒核酸復(fù)檢再次陽(yáng)性。給予阿比朵爾、左氧氟沙星、連花清瘟治療。第2次出院：2月21、23、25、29日取咽拭子檢測(cè)SARS-CoV-2核酸結(jié)果為陰性，經(jīng)專家組討論后予以出院。

病例2，男，56歲。接觸史：2020年1月16日與武漢相關(guān)人員接觸。發(fā)?。?月27日發(fā)熱(最高38.3 ℃)，于本院就診。確診治療：1月29日疾控中心檢測(cè)咽拭子SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性，結(jié)合臨床CT影像，診斷為COVID-19；1月30日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)醫(yī)院住院治療。出院：經(jīng)抗病毒治療后連續(xù)5 d無(wú)發(fā)熱，2月4、5日連續(xù)2次咽拭子病毒核酸檢測(cè)(間隔24 h以上)結(jié)果陰性，專家會(huì)診后，符合出院標(biāo)準(zhǔn)出院。轉(zhuǎn)診隔離：2月7日轉(zhuǎn)入本院隔離病區(qū)進(jìn)行醫(yī)學(xué)隔離觀察。復(fù)陽(yáng)：2月8日咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，2月15、16日再次采集咽拭子，結(jié)果均為陽(yáng)性。予以連花清瘟抗病毒等治療。第2次出院：分別于2月19、21、23、25日取鼻咽拭子行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性，經(jīng)專家組討論后予以出院。

病例3：男，37歲。旅居史：2020年1月12日從武漢回重慶。發(fā)?。?月16日，患者不明原因出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、腹瀉，1月21日于本院就診。確診治療：1月24日疾控中心取鼻咽拭子核酸檢測(cè)陽(yáng)性，診斷為COVID-19。1月27日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)一步治療。出院：經(jīng)干擾素霧化、洛匹那韋利托那韋片等抗病毒治療，2月12、13日兩次核酸檢測(cè)呈陰性，經(jīng)專家會(huì)診后，符合出院標(biāo)準(zhǔn)出院。轉(zhuǎn)診隔離：2月14日轉(zhuǎn)入本院隔離病區(qū)繼續(xù)進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察隔離治療。復(fù)陽(yáng)：2月16日，本院采集鼻咽拭子核酸檢測(cè)為陽(yáng)性，17日再次采樣核酸檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。本院予以連花清瘟抗病毒等治療。第2次出院：分別于2月19、21、23、25日取咽拭子行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性。經(jīng)專家組討論后予以出院。

2 實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測(cè)情況分析

3例COVID-19患者在診療過(guò)程中進(jìn)行了多次核酸檢測(cè)，分別選取碩世生物科技股份有限公司(以下簡(jiǎn)稱“碩世”)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(雙重?zé)晒?PCR法，批號(hào)20200108)，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司(以下簡(jiǎn)稱“達(dá)安”) SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，批號(hào)2020003)和湖南圣湘生物科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱“圣湘”)SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?，批?hào)2020003)，見(jiàn)表1。

表1 患者在確診、治療出院和出院后隔離過(guò)程中SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑基本情況和技術(shù)指標(biāo)

從核酸檢測(cè)結(jié)果分析可以看出，3例患者在疾控中心確診時(shí)核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，雙基因陽(yáng)性明顯；出院時(shí)兩次核酸檢測(cè)陰性；出院后在本院隔離觀察時(shí)檢測(cè)核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，結(jié)果呈雙基因弱陽(yáng)性。病例1、2、3的ORF1ab單基因Ct值達(dá)39.81、40.26和41.12，病例2、3的ORF1ab基因Ct值大于相應(yīng)核酸提取試劑的臨界Ct值40，但是分析熒光擴(kuò)增曲線有明顯的尾部抬高，說(shuō)明標(biāo)本細(xì)胞病毒載量已經(jīng)很低，呈弱陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 患者在不同時(shí)間不同核酸檢測(cè)機(jī)構(gòu)的核酸檢測(cè)情況(Ct值)

3 討 論

本文通過(guò)回顧性分析本院3例COVID-19患者在疾病初期確診、治療出院和轉(zhuǎn)診隔離過(guò)程中，分別對(duì)3家醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)結(jié)果情況及診療轉(zhuǎn)歸流程進(jìn)行分析，以下將探討核酸檢測(cè)假陰性影響因素和疾病治療過(guò)程中SARS-CoV-2排毒時(shí)間使出院患者核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)的可能原因。

3.1采集標(biāo)本病毒載量低 采集標(biāo)本時(shí)要符合以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1)要采集到含病毒的細(xì)胞標(biāo)本；(2)被感染者的細(xì)胞中有達(dá)到檢測(cè)限的病毒載量。如果標(biāo)本采集不規(guī)范，不能滿足以上兩個(gè)條件，將導(dǎo)致核酸檢測(cè)假陰性，可能造成出院患者核酸復(fù)陽(yáng)情況發(fā)生。

當(dāng)機(jī)體被病毒感染后，病毒首先通過(guò)鼻腔和口腔進(jìn)入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進(jìn)而到達(dá)肺泡，不同病程階段以及機(jī)體不同部位存在的病毒載量有所不同，是因?yàn)檫@些部位細(xì)胞所含病毒受體占比不同，所以不同時(shí)間范圍和不同的采樣部位可能意味著不同的核酸含量[10]。發(fā)病初期采集標(biāo)本時(shí)，病毒載量大的患者“取一次就陽(yáng)性一次”。對(duì)于治療康復(fù)期的患者，其體內(nèi)的病毒載量處于臨界點(diǎn)，采集到含有一定病毒載量的細(xì)胞標(biāo)本比較困難。

文中3例患者核酸檢測(cè)結(jié)果分析顯示，疾病發(fā)病初期確診階段，病毒載量大，病毒標(biāo)本采集比較容易，故病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，呈雙基因陽(yáng)性；在疾病治療隔離期，標(biāo)本中病毒載量低，檢測(cè)核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，其中病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值達(dá)39.81、40.26和41.12，表明出院后患者的病毒核酸檢測(cè)呈弱陽(yáng)性，病毒載量低。如果患者在出院時(shí)標(biāo)本采集不規(guī)范，并未采集到含有一定病毒載量的細(xì)胞，導(dǎo)致核酸檢測(cè)假陰性。因此，出院病例核酸復(fù)陽(yáng)的原因極大可能因?yàn)闃?biāo)本采集不合格，而造成患者病毒核酸檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。

本院對(duì)出院隔離患者進(jìn)行了多次核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)采集到深部咽拭子時(shí)能發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的帶血標(biāo)本，細(xì)胞量大，利于提高陽(yáng)性率；并且本院實(shí)行多部位采集、多樣本混合檢測(cè)，一次性采集2份鼻咽拭子和2份口咽拭子標(biāo)本，也利于提高陽(yáng)性率。

同時(shí)，加強(qiáng)培訓(xùn)，優(yōu)化和規(guī)范標(biāo)本采集方法，可提高核酸檢測(cè)陽(yáng)性率。疾病初期采集鼻咽拭子等上呼吸道標(biāo)本，治愈康復(fù)期最好采集深部咳痰或者肺泡灌洗液等下呼吸道標(biāo)本；規(guī)范采集的操作方法，掌握刮取標(biāo)本位置、停留時(shí)間和力度等采集技巧也有利于提高陽(yáng)性率。

3.2核酸檢測(cè)試劑靈敏度低 核酸檢測(cè)體外診斷試劑的可靠性非常重要，檢測(cè)的病毒核酸區(qū)域的選擇極為關(guān)鍵。為了提高檢測(cè)的靈敏度，多數(shù)廠家選擇病毒核酸序列中兩個(gè)或兩個(gè)以上的區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。但是每種試劑都有檢測(cè)靈敏度的下限，因此，對(duì)患者進(jìn)行咽拭子采樣時(shí)，病毒載量達(dá)不到檢測(cè)下限的時(shí)候，結(jié)果可能會(huì)呈現(xiàn)假陰性。郭元元等[11]也對(duì)6種國(guó)產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能進(jìn)行了比較與分析，其結(jié)果顯示，呈弱陽(yáng)性結(jié)果的患者標(biāo)本可能不易檢出，各試劑的結(jié)果存在一定的差異。

從本院3例患者核酸檢測(cè)結(jié)果分析可見(jiàn)，疾病發(fā)病初期確診時(shí)體內(nèi)病毒含量高，檢測(cè)病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，核酸試劑陽(yáng)性檢出率高；而在患者出院后康復(fù)過(guò)程中，患者病毒量低，檢測(cè)核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，呈弱陽(yáng)性。病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值達(dá)39.81、40.26和41.12，其病毒核酸ORF1ab基因Ct值達(dá)接近或者大于了核酸提取試劑所要求的臨界結(jié)果判斷值40，但是熒光擴(kuò)增曲線有明顯的尾部抬高，呈弱陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。此外，本院在對(duì)3例患者隔離期弱陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行多種核酸檢測(cè)試劑比對(duì)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，存在一定比例標(biāo)本單個(gè)靶區(qū)域陽(yáng)性的結(jié)果，說(shuō)明試劑對(duì)標(biāo)本不同區(qū)域的靈敏度確實(shí)存在差異，尤其在對(duì)弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，不同試劑的不同單基因陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)更為明顯。因此，如果核酸檢測(cè)試劑的靈敏度較低將會(huì)造成患者弱陽(yáng)性標(biāo)本的核酸檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。

3例患者在確診、治療、隔離觀察3個(gè)階段進(jìn)行了多次核酸檢測(cè)，均采用了不同的核酸提取試劑和核酸檢測(cè)試劑。由于試劑廠家研發(fā)時(shí)間短，各種試劑靈敏度不同，為200～1 000 copy/mL；在疫情特殊時(shí)期，也沒(méi)有使用已知臨床標(biāo)本進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，當(dāng)標(biāo)本中病毒載量低于檢測(cè)下限時(shí)，靈敏度低的核酸檢測(cè)試劑就無(wú)法檢出病毒。沈利華等[12]對(duì)3種國(guó)產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑進(jìn)行臨床效能評(píng)估發(fā)現(xiàn)，不同核酸檢測(cè)試劑和核酸提取方法的陽(yáng)性符合率和一致性均有較大的差異。

3.3病毒核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)與疾病病程發(fā)展和臨床治療用藥具有一定關(guān)系 SARS-CoV-2感染機(jī)體后，兩周內(nèi)產(chǎn)生抗體，因此，傳播風(fēng)險(xiǎn)較低，這種抗體對(duì)人體有保護(hù)作用，對(duì)病毒的清除也會(huì)持續(xù)進(jìn)行。ZHOU等[13]研究了SARS-CoV-2的排毒時(shí)間，指出137例出院患者的中位排毒時(shí)間為20 d，最短8 d，最長(zhǎng)可達(dá)37 d。肺炎是潛伏期較長(zhǎng)的疾病，部分COVID-19復(fù)陽(yáng)病例是處于炎癥在吸收過(guò)程中，不是臨床的痊愈，因此，可能存在產(chǎn)生間歇性排毒現(xiàn)象，但需要大樣本量、多中心研究進(jìn)行進(jìn)一步的證實(shí)。

3例患者均使用了抗病毒藥物等治療，從患者臨床表現(xiàn)和影像CT結(jié)果看，清除病毒治療有效，兩次核酸檢測(cè)陰性后，從定點(diǎn)醫(yī)院出院，符合診療規(guī)范。病例1、2、3從出院到核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)時(shí)間為2～7 d，其中病例1、2、3從確診病毒核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性到隔離觀察時(shí)病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性的時(shí)間分別是第18、22、27天，表明SARS-CoV-2在患者體內(nèi)存留時(shí)間不同，提示患者排毒時(shí)間可能與疾病病程發(fā)展有關(guān)，并且通過(guò)對(duì)病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值比較發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，體內(nèi)排毒量可能逐漸降低。因此COVID-19患者治療后期病毒排毒量和排毒時(shí)間的不確定，是否為患者核酸復(fù)陽(yáng)的原因均需有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本院對(duì)3例患者在隔離期檢測(cè)核酸復(fù)陽(yáng)后連續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，病例1、2、3在最后一次核酸陽(yáng)性2 d之后再行多次核酸檢測(cè)均為陰性。表明體內(nèi)病毒在逐漸清除可以達(dá)到完全康復(fù)。

綜上所述，COVID-19的診斷和治療是一個(gè)綜合臨床思辨的過(guò)程，要充分認(rèn)識(shí)到SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的影響因素較多，反復(fù)多次的核酸檢測(cè)具有一定必要性，同時(shí)重視提高檢測(cè)試劑的靈敏度，加強(qiáng)質(zhì)量控制和規(guī)范標(biāo)本的采集，從而提高診斷的陽(yáng)性率。COVID-19治療出院患者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)時(shí)，一種情況是疾病沒(méi)有完全治愈，臨床癥狀緩解，但是體內(nèi)還存在少量的病毒，可能因?yàn)闃?biāo)本采集不規(guī)范和各種試劑盒核酸檢測(cè)靈敏度不同，造成了患者體內(nèi)核酸檢測(cè)結(jié)果呈假陰性，導(dǎo)致COVID-19治療出院后的核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)；另一方面可能是患者體內(nèi)SARS-CoV-2排毒時(shí)間不規(guī)律和不確定導(dǎo)致出院后病毒核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)，還有待進(jìn)一步證實(shí)。為了防止出院后患者核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)，相關(guān)機(jī)構(gòu)需要制訂更加嚴(yán)格的出院標(biāo)準(zhǔn)，可以增加SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的次數(shù)，同時(shí)，增加對(duì)SARS-CoV-2特異性抗原、抗體檢測(cè)[14]，綜合判斷COVID-19患者診斷標(biāo)準(zhǔn)和出院標(biāo)準(zhǔn)，減少感染風(fēng)險(xiǎn)。