蔡 偉，吳嘯天，薛建江

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 410331)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的一種肺炎，該病毒屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～40 nm，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有明顯區(qū)別[1]。基于目前的流行病學(xué)調(diào)查，該病潛伏期1～14 d，多為3～7 d，GUAN等[2]研究顯示，有個(gè)別病例潛伏期長(zhǎng)達(dá)24 d。患者臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、乏力、干咳為主，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性或病毒基因測(cè)序與已知的SARS-CoV-2高度同源作為確診的依據(jù)[3]。相對(duì)基因測(cè)序，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是較為簡(jiǎn)單且快速的檢測(cè)方法。但核酸檢測(cè)假陰性率較高，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]也指出，對(duì)于疑似病例尤其是臨床表現(xiàn)不典型的患者要盡可能采取快速抗原、抗體檢測(cè)等多種方法以便對(duì)核酸檢測(cè)起必要的補(bǔ)充作用。以下是本院對(duì)1例臨床表現(xiàn)不典型的COVID-19患者進(jìn)行SARS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)的診治過(guò)程，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者為本院收治的第1例疑似SARS-CoV-2感染的患者，男，25歲，自由職業(yè)，未婚，重慶市沙坪壩區(qū)土主鎮(zhèn)人，于武漢務(wù)工，獨(dú)居?；颊咦允?020年1月22日欲返渝，21日18:00與朋友共3人在家中聚餐，次日獨(dú)自駕車返渝，此后一直在家并未外出，也無(wú)親戚走訪，其間未感明顯不適。2月5日，了解到在武漢聚過(guò)餐的朋友確診為COVID-19，2月7日22:15至本院發(fā)熱門診就診并主動(dòng)要求隔離治療。接診后，本院按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》[3]的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合流行病學(xué)史及患者主訴，將患者收入本院隔離觀察病房。

1.2儀器與試劑 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法定性檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體，試劑盒購(gòu)自博奧賽斯(重慶)生物科技有限公司(國(guó)械注準(zhǔn)：20203400182/400183；試劑批號(hào)：Z202002043/Z202002040)；全自動(dòng)博奧塞斯 Axceed260化學(xué)發(fā)光分析儀用于抗體檢測(cè)。SARS-CoV-2 ORF1ab/N基因雙重核酸檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?熒光PCR法)購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司(國(guó)械注準(zhǔn)：20203400064；試劑批號(hào)：2020002)及上海捷諾生物科技有限公司(國(guó)械注準(zhǔn)：20203400058；試劑批號(hào)：COV2020007)；核酸提取試劑盒(滬浦械備：20160107號(hào) PZ0190601)及 EX3600全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司；SLAN-96P熒光定量PCR儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 嚴(yán)格按相關(guān)要求采集并及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)患者咽拭子及靜脈血標(biāo)本用于SARS-CoV-2及免疫球蛋白的測(cè)定。采用無(wú)抗凝劑真空采血管采集患者靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，1 500～2 000 r/min離心10 min，分離血清備用。

1.3.2核酸檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法，針對(duì)SARS-CoV-2基因組中開(kāi)放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白(N)基因進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及廠家說(shuō)明書設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件及進(jìn)行核酸檢測(cè)結(jié)果Ct值的判讀。SARS-CoV-2檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)：需同時(shí)滿足同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2的ORF1ab及N基因檢測(cè)雙陽(yáng)性，單一基因陽(yáng)性需查找原因、重新采集標(biāo)本復(fù)查。

1.3.3血清抗體檢測(cè) 采用全自動(dòng)磁微粒化學(xué)發(fā)光法分析技術(shù)定性檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體，臨界值(cut-off值)定為97.5%CI，即為陽(yáng)性對(duì)照發(fā)光均值×0.1+陰性對(duì)照發(fā)光均值。標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果S/CO=標(biāo)本發(fā)光值/cut-off值，若標(biāo)本S/CO<1，檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性；標(biāo)本S/CO≥1，檢測(cè)結(jié)果判定為陰性；標(biāo)本S/CO 0.7～1時(shí)為灰區(qū)，建議3～5 d后重新抽血復(fù)查。

2 結(jié) 果

根據(jù)患者流行病學(xué)史及主訴，患者偶有干咳，無(wú)發(fā)熱，體溫36.7 ℃，脈搏75次/分鐘，心率18次/分鐘，血壓110/71 mm Hg。查體：全身皮膚黏膜無(wú)蒼白黃染，無(wú)瘀斑瘀點(diǎn)；瞼結(jié)膜無(wú)蒼白，鞏膜無(wú)黃染；淺表淋巴結(jié)未捫及腫大；口唇紅潤(rùn)無(wú)發(fā)紺；雙肺呼吸音清，雙下肺未聞及濕啰音。血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)5.6×109/L，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)0.36×109/L，C反應(yīng)蛋白(CRP)5.2 mg/L，9項(xiàng)呼吸道病原體IgM抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陰性；肝功能、心肌酶譜及胸部CT片等未見(jiàn)明顯異常。2020年2月8日、10日本院先后采集其咽拭子標(biāo)本分別送重慶市疾病預(yù)防控制中心(以下簡(jiǎn)稱“疾控中心”)及本院檢驗(yàn)科進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)(本院自2月10日起開(kāi)展SARS-CoV-2核酸及抗體檢測(cè)工作)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性；但2月10日患者于本院送檢血清檢測(cè)SARS-CoV-2特異性抗體IgM、IgG為陽(yáng)性，見(jiàn)表1。

表1 患者SARS-CoV-2核酸及抗體檢測(cè)結(jié)果

2月12日患者轉(zhuǎn)至重慶市公共衛(wèi)生救治中心(以下簡(jiǎn)稱“公衛(wèi)中心”)行一步觀察及治療。當(dāng)日再次取樣送至疾控中心檢測(cè)(標(biāo)本包括咽拭子、糞便標(biāo)本)，次日結(jié)果顯示咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果陰性，糞便標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。2月14日再次取樣復(fù)測(cè)，結(jié)果同前。2月14日加查抗體，結(jié)果IgM、IgG仍陽(yáng)性。

3 討 論

本研究納入的患者臨床表現(xiàn)不典型，兩次核酸結(jié)果為陰性，符合解除隔離及出院標(biāo)準(zhǔn)[5]，若首診未檢測(cè)SARS-CoV-2特異性抗體，此患者極有可能會(huì)被漏診。反觀該患者多次核酸檢測(cè)的結(jié)果，如果僅采集上呼吸道標(biāo)本如咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，也會(huì)造成漏診。由于SARS-CoV-2造成的肺炎為下呼吸道感染，對(duì)于已有癥狀及肺部CT改變的患者來(lái)說(shuō)，下呼吸道標(biāo)本(如深部咳痰、灌洗液等)為核酸檢測(cè)的首選標(biāo)本，且呼吸道標(biāo)本中的SARS-CoV-2核酸檢出率由高到低依次為肺組織(金標(biāo)準(zhǔn))>支氣管肺泡灌洗液>抽吸痰或咳痰>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子。本例患者下呼吸道感染癥狀不明顯，臨床并未送檢。因本院采用的試劑盒說(shuō)明書未提及血清標(biāo)本的檢測(cè)，故未建議臨床送檢血清。

隨著對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)的深入研究，有專家共識(shí)也提出可用患者的血清、糞便等標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸的檢測(cè)[5]，表明了SARS-CoV-2感染后可能會(huì)影響機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)，標(biāo)本類型應(yīng)多樣化。盡管如此，核酸檢測(cè)陽(yáng)性仍是COVID-19確診的標(biāo)準(zhǔn)，但由于受到標(biāo)本采集的規(guī)范性問(wèn)題、標(biāo)本類型及質(zhì)量問(wèn)題、操作人員技術(shù)問(wèn)題等因素的影響，目前假陰性率仍較高。作為一項(xiàng)病毒核酸檢測(cè)技術(shù)，其結(jié)果影響因素也涵蓋了檢測(cè)前、檢測(cè)中、檢測(cè)后各個(gè)方面。可能由于最初主要采集鼻咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)COVID-19患者又少有深部咳痰等下呼吸道標(biāo)本，因此，檢測(cè)前因素對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響比較大。而已有的文獻(xiàn)報(bào)道，COVID-19患者發(fā)熱第7天后，采用熒光定量RT-PCR法在血液、糞便、尿液標(biāo)本中均未檢測(cè)出SARS-CoV-2，意味著核酸檢測(cè)用于診斷發(fā)病7 d以后的COVID-19患者可能出現(xiàn)漏診[6]。為了更進(jìn)一步明確SARS-CoV-2感染患者的診斷，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]指出對(duì)于疑似病例要盡可能采取快速抗原及抗體檢測(cè)等多種方法，目前實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)展SARS-CoV-2 IgM及IgG抗體檢測(cè)，更為靈敏的核酸檢測(cè)方法如數(shù)字PCR也有一定的應(yīng)用，有望在SARS-CoV-2的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。

從臨床診斷方面來(lái)看，由于SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)，患者病情進(jìn)展較快，部分患者臨床表現(xiàn)輕微，不容易引起重視。一旦發(fā)展為重癥病例則可突然惡化，引起患者死亡。如果能及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)病毒感染并給予救治，將會(huì)極大降低肺炎患者的病死率。因此，在核酸檢測(cè)存在一定假陰性風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，抗體檢測(cè)對(duì)COVID-19的診斷顯得尤為重要，且用于抗體血清學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本來(lái)源于外周血清或血漿標(biāo)本，其采集和保存簡(jiǎn)單易行，抗體在血清標(biāo)本中的穩(wěn)定性也較好，從而提高了檢測(cè)的靈敏度[7]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》[8]已將血清SARS-CoV-2特異性IgM及IgG抗體陽(yáng)性及血清SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期升高4倍及以上納入了疑似病例確診標(biāo)準(zhǔn)。

在人體接觸抗原時(shí)，IgM是最早產(chǎn)生的抗體，IgG抗體晚于IgM抗體出現(xiàn)，IgG抗體在體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，可作為流行病學(xué)調(diào)查檢測(cè)指標(biāo)?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》[8]還指出SARS-CoV-2特異性IgM抗體多在發(fā)病3～5 d后開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性，IgG抗體滴度恢復(fù)期較急性期增高4倍及以上。但即使檢測(cè)出SARS-CoV-2特異性IgM、IgG抗體陽(yáng)性仍需結(jié)合臨床及核酸檢測(cè)等綜合診斷。因?yàn)楹怂釞z測(cè)的是病毒RNA，是病毒存在的直接證據(jù)；抗體檢測(cè)是檢測(cè)患者血液中被刺激產(chǎn)生的抗體，是間接證據(jù)。間接證據(jù)可以對(duì)臨床有所提示，但仍需直接證據(jù)進(jìn)行確診。

綜上所述，通過(guò)本例患者表明SARS-CoV-2特異性IgM、IgG抗體的檢測(cè)可作為核酸檢測(cè)的一種有效補(bǔ)充，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)COVID-19肺炎患者尤其是臨床表現(xiàn)不典型患者的診斷具有重要的臨床意義。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，特異性抗體檢測(cè)是認(rèn)識(shí)SARS-CoV-2感染發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸的重要手段，本課題組將通過(guò)大量臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)研究。