羅文龍，張新會，崔 茜，王 超，李軼男，余學(xué)文，裴漢軍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)三科)

造影劑腎病(Contrast induce nephropathy，CIN)是臨床介入診療中的常見并發(fā)癥，隨著介入診療的廣泛開展，其發(fā)病率也逐年上升，主要病理生理過程是腎缺血[1]。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理(Remote ischemic preconditioning，RIPC)是一項(xiàng)較好的CIN預(yù)防措施，RIPC預(yù)防CIN的機(jī)制尚未明確，目前對于RIPC預(yù)防CIN機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制和細(xì)胞分子信號通路機(jī)制上。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)急性期RIPC組和延遲期RIPC組較IR組血Cr、BUN、微量白蛋白(mALB)、β2-微球蛋白(β2-MG)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)水平均降低，超氧化物歧化酶(SOD)水平升高，證實(shí)RIPC對大鼠缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[2]。

信號轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transcription factor 3，STAT3)是一種DNA結(jié)合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑能夠下調(diào)JAK-STAT3途徑，與細(xì)胞因子受體結(jié)合后能夠增加JAK和STAT3蛋白的水解，減弱JAK激酶活性。活化蛋白抑制劑能夠特異性結(jié)合STAT3單體而阻止STAT3二聚化，繼而減少其靶基因的表達(dá)。當(dāng)前研究結(jié)果在STAT3對缺血再灌注損傷的作用方面存在分歧，有些研究顯示STAT3可以減輕缺血再灌注對組織的損傷。例如，Yamashita等發(fā)現(xiàn)，激活STAT3能降低促凋亡蛋白Bax水平，升高抑制凋亡蛋白Bcl-2水平，減少腦細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減小腦梗死面積，起到腦保護(hù)作用[3]。Smith等研究表明，激活小鼠心肌STAT3基因能夠減輕阿霉素引起的小鼠心肌細(xì)胞損傷，說明STAT3對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[4]。另一些研究顯示STAT3可以加重組織缺血再灌注損傷，例如，Mascareno等在大鼠心臟缺血再灌注損傷模型中觀察到，心肌缺血再灌注損傷時(shí)JAK-STAT通路被激活，缺血期和再灌注2 h，JAK2、STAT1、STAT3、STAT5a和STAT6表達(dá)水平均升高，用ACA90(JAK2阻斷劑)處理后下調(diào)了JAK2水平，減弱了心肌的缺血再灌注損傷，說明上調(diào)JAK-STAT途徑可誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷，而抑制該途徑有改善缺血再灌注損傷的作用[5]。既往STAT3在腎缺血再灌注損傷中的作用研究很少，本研究通過觀察RIPC對急性腎缺血小鼠腎組織蛋白STAT3表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討STAT3在RIPC預(yù)防腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。

1 對象與方法

1.1研究動物及試劑 選取健康的C57BL/6小鼠，8～10周齡，體重20～25 g，共30只。實(shí)驗(yàn)動物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0002]，置于空調(diào)飼養(yǎng)室中，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室清潔級標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行飼養(yǎng)，并保持動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度適宜、安靜，且滿足12 h光照、12 h黑暗的光照周期，定期更換飼料及飲用水，保證動物自由進(jìn)食水。本研究嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例，并獲得內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。血肌酐試劑盒購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司,STAT3抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組及建模

1.2.1.1實(shí)驗(yàn)動物分組 30只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為3組，即腎缺血再灌注組(IR)、遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理組(RIPC)和正常對照組，每組10只。

1.2.1.2實(shí)驗(yàn)動物模型制備 (1)缺血再灌注組：將麻醉后的小鼠固定于動物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺上，雙側(cè)背部切口暴露腹腔，鈍性游離雙側(cè)腎蒂，用微動脈止血夾夾閉雙側(cè)腎蒂，夾閉30 min后撤除止血夾，恢復(fù)腎臟灌注，復(fù)位腎臟，縫合雙側(cè)背部創(chuàng)口。(2)遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理組(RIPC)：結(jié)扎小鼠左側(cè)下肢，進(jìn)行3個(gè)周期交替5 min結(jié)扎和松開，其余同缺血再灌注組。(3)正常對照組：不進(jìn)行雙側(cè)背部切開及腎蒂夾閉等手術(shù)操作。

1.2.2小鼠血肌酐測定 將各組小鼠血液樣本3 000 rpm條件下離心5 min，根據(jù)組別將離心后的血清移至生化分析儀樣本瓶中，按照血肌酐檢測試劑盒說明書，使用生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.3Western blot法檢測腎組織STAT3 (1)提取小鼠腎組織中的總蛋白：取適量大小的腎組織放入干凈的1.5 mL離心管中，并標(biāo)號。將組織裁剪成細(xì)小的碎片，加入600 μL的組織裂解液，并加入1 %蛋白酶抑制劑。用超聲儀超聲20次(50強(qiáng)度，工作/間歇時(shí)間50 %)。于4 ℃、12 000 g下離心5 min，將上清用移液器移入新的1.5 mL離心管中，置于-80 ℃留存。(2)蛋白濃度測定：取新96孔板，在板蓋標(biāo)號。A、B排為標(biāo)準(zhǔn)曲線，做兩個(gè)重復(fù)孔，加一個(gè)空白對照；C、D為樣品編號，做兩個(gè)重復(fù)孔。稀釋蛋白液(4 μL蛋白液加8 μL去離子水)。配制工作液(100 μL)，將試劑盒中A、B液混合，比例為50∶1。在孔板中加入工作液和蛋白稀釋液，比例為工作液：蛋白稀釋液(或標(biāo)曲)=20∶1。蓋上板蓋，37 ℃恒溫震蕩器搖30 min，放入酶標(biāo)儀檢測吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算樣品蛋白濃度。(3)SDS-PAGE凝膠的制備：取出灌膠玻璃板將其清洗干凈，待干燥后使用。隨后配制10 %的分離膠7.5 mL，將配置好的分離膠迅速用移液器移至凝膠玻璃槽中，使其液面到標(biāo)志線位置(樣品梳下方0.5～1 cm處)，立即用去離子水將膠面覆蓋，有助于隔絕空氣，保持室溫25 ℃，放置大約40 min，直至分離膠凝固。倒掉上層去離子水，用吸水紙吸走殘余液體，把凝膠板再次垂直放置，將配置好的5 %的濃縮膠液2.5 mL迅速用移液器移至凝膠玻璃槽中，要避免產(chǎn)生氣泡，將樣品梳快速插入凝膠玻璃槽中，室溫條件下凝固30 min。隨后輕輕拔出樣本梳，用夾子把玻璃夾緊，放置于電泳槽上，凹面緊貼電泳槽。(4)樣本變性及電泳：將總蛋白樣本從-80 ℃冰箱拿出，依據(jù)測出的蛋白濃度結(jié)果計(jì)算上樣量。將20 μg加熱變性后的樣品按照由濃度計(jì)算所得體積分別輕輕添加到凝膠孔中，把電泳儀接通電源，并將電壓調(diào)到90 V使樣品通過濃縮膠，120 V通過分離膠，當(dāng)電泳至分離膠合適位置時(shí)停止電泳。(5)凝膠的轉(zhuǎn)模和檢測：第一步，把剪好的PVDF用100 %甲醇浸泡5 min。第二步，先將3層濾紙剪裁成與膠同樣大小，再將3張濾紙裁剪成稍微小一點(diǎn)尺寸，后將濾紙用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用。第三步，將電泳板取下、平置(使“凹”面玻璃板位于下面)，仔細(xì)分開兩層玻璃板，拿掉上面玻璃板，去除玻璃板上的多余凝膠，用電轉(zhuǎn)液漂洗含樣本的凝膠。第四步，取出轉(zhuǎn)模夾板浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，由陰極側(cè)開始，依次放入纖維墊、3層濾紙、樣品膠、PVDF膜、三層濾紙，注意清除氣泡。第五步，連接轉(zhuǎn)膜電泳儀連線進(jìn)行轉(zhuǎn)模，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min。第六步，封閉：先用脫脂奶粉和1×TBST(1∶20)配制封閉液，放入轉(zhuǎn)有樣品蛋白的PVDF膜，封閉2 h。第七步，一抗反應(yīng)：先用稀釋液稀釋STAT3抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶1 000)，然后分別放入封閉后的PVDF膜，4 ℃反應(yīng)過夜。第八步，洗膜：一抗反應(yīng)結(jié)束后用1×TBST洗膜3次，5 min/次。第九步，二抗反應(yīng)：先用稀釋液稀釋山羊抗兔IgG的二抗(1∶20 000)，然后分別放入一抗反應(yīng)后的PVDF膜，室溫下作用60 min。第十步，洗膜3次，5 min/次。第十一步，曝光。第十二步，UVP凝膠成像分析系統(tǒng)采圖，分析軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血肌酐結(jié)果分析 IR組與對照組相比，小鼠的血肌酐水平升高(t=2.740,P=0.0255)；RIPC組與IR組比較，小鼠的血肌酐水平下降(t=2.341,P=0.0473)，補(bǔ)充3組數(shù)據(jù)，見圖1-a。

2.2小鼠腎組織STAT3蛋白檢測結(jié)果 采用Western blot方法對各組小鼠腎組織樣本進(jìn)行STAT3蛋白檢測，得到相應(yīng)蛋白條帶結(jié)果，見圖1-b。對照組小鼠腎組織的STAT3蛋白比值為(0.9360±0.2728)，IR組的蛋白比值為(1.6893±0.2971)，RIPC組小鼠的蛋白比值為(0.8900±0.2373)，組間比較，發(fā)現(xiàn)IR組與對照組相比，小鼠腎組織STAT3水平升高(P<0.05)；RIPC組與IR組比較，小鼠腎組織STAT3水平下降(P<0.05)，見圖2。

3 討論

本研究在小鼠腎缺血再灌注模型中驗(yàn)證了缺血再灌注可以導(dǎo)致腎損傷，遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理可以減輕缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷。檢測小鼠腎組織中STAT3水平，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后STAT3水平升高，經(jīng)遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理后，STAT3水平下降。說明STAT3表達(dá)下降可能與RIPC保護(hù)腎缺血再灌注損傷有關(guān)，RIPC可能通過抑制STAT3表達(dá)減輕腎損傷。

目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激與CIN的發(fā)生有關(guān)[6]。氧化應(yīng)激狀態(tài)產(chǎn)生的活性氧可以直接使線粒體Bax/Bcl-2升高，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，繼而引起細(xì)胞凋亡[7]。在造影劑誘導(dǎo)的AKI動物模型中觀察到，通過使用血紅素加氧酶-1可以使Bax/Bcl-2比率降低，促凋亡蛋白caspase-3活性被抑制，從而減輕氧化應(yīng)激引發(fā)的凋亡和腎功能障礙。在MAPK途徑中，ROS能夠誘發(fā)JNK和p38磷酸化，進(jìn)而激活caspase增加細(xì)胞凋亡。Michele等人研究發(fā)現(xiàn)，造影劑可以激活p38、JNKs和NF-kB通路，引發(fā)STAT3磷酸化水平增加，導(dǎo)致HK-2細(xì)胞活力下降[8]。在造影劑誘導(dǎo)的大鼠模型中，通過使用抗氧化劑N型乙酰半胱氨酸，能減少JNK和p38磷酸化和凋亡發(fā)生[9]。史永紅等發(fā)現(xiàn)抑制JAK-STAT信號途徑后可減少TGF-β1表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成，減輕細(xì)胞的增殖狀態(tài)，從而產(chǎn)生的腎保護(hù)作用[10]。當(dāng)前學(xué)者對JAK2/STAT3途徑研究較為充分，高糖環(huán)境、血管緊張素Ⅱ、氧化應(yīng)激均能激活JAK2/STAT3通路，引發(fā)糖尿病腎病患者組織炎癥[11]。王珂等的研究也證實(shí)了上調(diào)STAT3可以加重缺血缺氧誘導(dǎo)的組織損傷[12]。本研究也顯示STAT3水平升高可以加重腎缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果提示在CIN早期RIPC抑制STAT3表達(dá)，RIPC的腎保護(hù)作用部分是通過抑制JAK/STAT信號途徑實(shí)現(xiàn)的。為了更好了解STAT3在CIN中的作用及具體機(jī)制，還需要大量研究。