張 艷,田曉玲,李思思,楊金月,華 川,2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢430061;2.湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢430074)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19),簡稱新冠肺炎,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、氣促、呼吸困難等,可并發(fā)嚴(yán)重的急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭,危重者可致死亡[1]。國家中醫(yī)藥管理局相繼發(fā)布了COVID-19的中醫(yī)藥預(yù)防方案及臨床診療方案,中醫(yī)藥積極參與疫情防控取得了滿意的臨床療效[2]。蔣鵬飛等[2]分析全國各地區(qū)COVID-19中醫(yī)藥預(yù)防方案,發(fā)現(xiàn)金銀花的使用頻次最高,且四川省、湖南省、黑龍江省、浙江省、云南省、北京市等地區(qū)均有將金銀花、連翹共同使用的預(yù)防方藥。研究表明,清熱解毒類中藥具有抗病毒、解熱、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等作用,金銀花、連翹提取物能直接通過抑制病毒蛋白的增殖表達(dá)而發(fā)揮抗病毒的作用[3]?！兜崮媳静荨费越疸y花:“清熱,解諸瘡,癰疽發(fā)背,丹流瘰疬?！薄渡褶r(nóng)本草經(jīng)》言連翹:“主寒熱,鼠瘺,瘰疬,癰腫惡瘡,癭瘤,結(jié)熱。”研究表明,金銀花含有黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等成分,連翹化學(xué)成分包括苯乙醇苷類、木脂素類、萜類和黃酮類等,兩藥配伍具有抗病毒、抗菌、解熱、抗炎等功效[4]。本研究基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,通過構(gòu)建“中藥-靶點-疾病”互作網(wǎng)絡(luò),闡釋金銀花、連翹通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用機(jī)制,以期為臨床治療COVID-19提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選中藥活性成分 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)和中草藥有效成分蛋白靶點數(shù)據(jù)庫(http://lifecenter.biosino.org/hit/,HIT)檢索金銀花、連翹的化學(xué)成分,篩選口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18的活性成分。

1.2 預(yù)測藥物候選靶點 檢索TCMSP、藥物數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/,Drugbank),獲取藥物候選靶點信息。利用歐洲蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫(https://uniprot.org,UniProt)的uniprot KB搜索功能,規(guī)范藥物候選靶點的蛋白名稱,設(shè)定篩選物種為“homo sapiens”。

1.3 疾病靶點 通過人類基因數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/,GeneCards數(shù)據(jù)庫)檢索以“corona virus”“pneumonia”為關(guān)鍵詞的 COVID-19靶點。利用uniprot KB搜索功能規(guī)范COVID-19靶點的蛋白名稱,設(shè)定篩選物種為“homo sapiens”。

1.4 藥物-疾病潛在靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 取藥物活性成分靶點與COVID-19靶點的交集,得到藥物-疾病潛在靶點。將潛在靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中繪制“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及生物信息學(xué)分析 將藥物候選靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)進(jìn)行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,設(shè)定物種為“homo sapiens”,將蛋白互作結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,并繪制PPI網(wǎng)絡(luò),分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),篩選關(guān)鍵蛋白靶點,并通過MCODE算法對PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分候選靶點及疾病相關(guān)靶點 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出金銀花活性成分23個、連翹活性成分23個,其中共有活性成分4個[β-谷甾醇(betasitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)],兩種藥物去重后得到活性成分共42個,見表1。查閱相關(guān)文獻(xiàn)補充金銀花、連翹未滿足篩選條件的活性成分4個,分別為綠原酸(chlorogenic acid)、連 翹 酯 苷 A/B(forsythialan A/B)、熊 果 酸(ursolic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)。上述46個活性成分共檢索出518個活性成分靶點,去重后得到214個靶點。見表1。

2.2 藥物-疾病潛在靶點 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索,獲得與COVID-19相關(guān)的靶點基因1 150個。將金銀花、連翹的作用靶點與COVID-19的靶點相映射,利用韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.es/tools/venny/,venny diagram)得到交集靶點(潛在靶點)59個。見圖1(掃描標(biāo)題處二維碼,下同)。

2.3 “藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將金銀花、連翹活性成分與藥物-疾病潛在靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2,繪制“藥物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

表1 金銀花、連翹主要活性成分信息

2.4 潛在靶點生物信息分析及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 ①用DAVID 11.0軟件對59個潛在靶點進(jìn)行GO功能分析,得到生物過程(biological process,BP)118條、分子功能(molecular function,MF)22條,細(xì)胞成分(cell composition,CC)26條。生物過程主要涉及脂多糖介導(dǎo)的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to hypoxia)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、蛋白質(zhì)寡聚化的正調(diào)控(positive regulation of protein oligomerization)、宿主共生體生長的負(fù)調(diào)控(negative regulation of growth of symbiont in host)等過程;分子功能主要參與細(xì)胞外機(jī)制(extracellular space)、線粒體(mitochondrion)、過氧化物酶體(peroxisome)等過程;細(xì)胞成分主要參與跨膜蛋白結(jié)合(identical protein binding)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)等過程。見圖3。②應(yīng)用DAVID 11.0數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進(jìn)行通路分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)得到100條相關(guān)的信號通路。主要涉及TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Fox O 信號通路(Fox O signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等病理通路,提示金銀花、連翹活性成分可能通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、解熱止痛、鎮(zhèn)靜等方面防治COVID-19。見圖4。

2.5 潛在靶點的MCODE算法模塊分析 采用Metascape中BioGrid數(shù)據(jù)庫的PPI和MCODE算法模塊分析功能,得到潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及3個重要模塊。網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點數(shù)59個,邊730條,平均節(jié)點度24.760,平均局部聚類系數(shù)0.751。3個重要模塊共16個靶點(模塊1:AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2,模塊 2:APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14,模塊3:EGF、GJA1、EGFR、INS)。見圖5。

3 討論

新型冠狀病毒感染人體后存在一定潛伏期,當(dāng)人體免疫力低下時,病毒入侵呼吸系統(tǒng),引起一系列炎癥反應(yīng),如咳嗽、咯痰、喘息等表現(xiàn)。新型冠狀病毒屬中醫(yī)“戾氣”范疇,其病位在肺,主要病機(jī)為濕、毒,治療以解毒化濕貫穿始終。目前,新型冠狀病毒的疫苗正在研發(fā)階段,中醫(yī)預(yù)防和治療該病尤為重要[5]。清熱類中藥金銀花、連翹是COVID-19防治的主要中藥,但其作用機(jī)制尚未完全清楚。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子水平預(yù)測金銀花、連翹治療疾病的相關(guān)靶點和通路等,可為COVID-19研究提供參考。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過“藥物-靶點-疾病”多層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[6],融合多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容,從整體角度探索中藥與疾病的關(guān)聯(lián)性,具有整體性、系統(tǒng)性的特點,得到越來越廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。研究表明,發(fā)熱是COVID-19重要的臨床表現(xiàn)之一,其機(jī)制可能與IL(白介素)-1β、IL-6、TNF(腫瘤壞死因子)等內(nèi)源性致熱原相關(guān)[7]。TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的啟動因子,能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子釋放,如IL-6、IL-1β等,共同對組織造成損傷,其中IL-6是造成細(xì)胞因子風(fēng)暴的典型促炎因子[8]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測金銀花、連翹治療COVID-19的作用機(jī)制,獲得金銀花、連翹活性成分46個,主要涉及黃酮類、木脂素類、揮發(fā)油類、苯乙醇苷類等,共有活性成分為β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素。研究表明,黃酮類化合物,尤其是槲皮素,具有廣泛的活性,具有抗氧化、降血糖、抑制腫瘤等,可應(yīng)用于治療各種炎癥[9]。木犀草素抗病毒活性體現(xiàn)在對抗登革熱病毒,限制其病毒體的成熟過程,降低毒血癥的發(fā)生[10]。金銀花的石油醚、丙酮、乙醇、水提取物均具有抑制流感病毒的作用[11]。連翹脂素可干預(yù)TNF-α、IL-6等通路,發(fā)揮抗炎抑制作用[12]。連翹富含的木脂素類、苯乙醇苷類及黃酮類等也具有抗炎活性[13]。

金銀花、連翹有效活性成分對應(yīng)的藥物候選靶點與COVID-19疾病相關(guān)靶點映射得到59個潛在靶點。通過進(jìn)一步的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與重要模塊子網(wǎng)絡(luò)提取,共獲得16個靶點(AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2、APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14、EGF、GJA1、EGFR、INS)。新型冠狀病毒經(jīng)過呼吸道侵犯肺部,容易引發(fā)肺部缺氧和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)與炎癥關(guān)系密切,可通過促炎基因涉及的反轉(zhuǎn)錄機(jī)制直接轉(zhuǎn)錄下調(diào)影響炎癥反應(yīng)[14]。EGF、EGFR等表皮生長因子參與細(xì)胞增殖,可在VCAM1的黏附作用下促進(jìn)內(nèi)皮屏障的重建,改善急性肺損傷[15]。

潛在靶點通路主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、Fox O信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等。研究表明,TNF信號通路中的TNF-α在炎癥反應(yīng)早期可大量釋放,誘導(dǎo)IL-1、IL-6等促炎因子的產(chǎn)生[16]。PI3K/Akt信號通路參與氧化應(yīng)激、自噬、炎癥等多種病理活動,影響IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子表達(dá)[17]。HIF-1信號通路可多途徑調(diào)控VEGF、TGF-β1等靶基因的表達(dá),改善氣道炎癥及氣道重塑,緩解咳嗽、咯痰、喘息等癥狀[18]。

綜上所述,在本研究構(gòu)建的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)中,金銀花、連翹通過槲皮素、木犀草素、苯乙醇苷等多種活性成分,作用于TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路等發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、解熱止痛、鎮(zhèn)靜等作用。但鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性,后續(xù)還需加強實驗設(shè)計,并進(jìn)行實驗證實。