許曾焜，李 凱，劉永振，高 立，劉長軍，張艷萍，高玉龍，祁小樂，崔紅玉，王笑梅

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生?。≧eticuloendotheliosis，RE）是由RE 病毒（REV）群的反轉(zhuǎn)錄病毒引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一群病理綜合征，包括急性網(wǎng)狀細胞腫瘤形成、矮小綜合征和淋巴組織與其他組織慢性腫瘤[1-2]。流行病學調(diào)查研究顯示，REV 在我國的流行與分布十分廣泛[3-5]。REV 感染后造成機體免疫抑制，影響其他疫苗的免疫效果，并致使感染雞易于繼發(fā)細菌和其它病毒感染，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6-7]。REV 在現(xiàn)地養(yǎng)殖過程中，也常與其它禽免疫抑制性病毒以及禽腫瘤病毒（例如雞馬立克氏病病毒、雞傳染性貧血病病毒和禽白血病病毒等）發(fā)生混合感染[8-9]。多種病毒混合感染常發(fā)生協(xié)同致病作用，使得上述疫病防控難度進一步增加。

疫苗免疫是防控動物疫病的主要手段。然而，目前國內(nèi)外尚無有效的商品化疫苗用于RE 的預防。REV 在感染過程中能夠整合入宿主細胞基因組中，導致其在雞群中垂直傳播。傳統(tǒng)全病毒弱毒活疫苗的使用將帶來一定的安全隱患，并存在毒力返強的風險。REV 編碼的gp90 蛋白是病毒的保護性抗原，可以誘導機體中和抗體的產(chǎn)生[10]?；谠摬《緂p90 蛋白構(gòu)建的基因工程疫苗由于不含全病毒，因此在安全性方面優(yōu)勢突出，是研制RE 疫苗的一種理想選擇。雞馬立克氏病病毒（MDV）作為一種皰疹病毒，基因組較大且其基因組中含有多個可供外源基因插入的復制非必需區(qū)，是研制重組活載體疫苗的理想載體[11]。本研究將REV 的保護性抗原基因gp90 表達框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組的US2 基因內(nèi)部，構(gòu)建了表達REV gp90 蛋白的重組MDV，并對構(gòu)建的重組病毒r814-gp90 進行了生物學特性的研究，為RE 重組MDV 活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞和病毒 pCAGGS 由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；pENTR1 載體、克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重組質(zhì)粒pUC57-gp90、 克隆有Kan/ccdB 基因的重組粘粒p814-5US2KanccdB、克隆有血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組的5 個重組粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊構(gòu)建并保存。大腸桿菌EPI300 株購自EPICENTRE 公司；雞胚成纖維細胞（CEF）由9～10 月齡SPF 雞胚制備。血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊鑒定并保存。

1.2 主要試劑 常規(guī)PCR 反應酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa 公司；Gateway?LR ClonaseTMII Enzyme Mix 和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，均購自Invitrogen公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN 公司；細胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自BioFroxx 公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800 標記的羊抗兔IgG，購自Licor 公司；gp90 單克隆抗體（MAb）由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊制備并保存。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)REV HLJR0901 株（GQ415646）基因組序列，利用Oligo 7.0 軟件設計擴增gp90 基因引物gp90F：5'-GAATTCATGGACTGC CTGACCAACCTG-3'/gp90R：5'-TTTATCGATTCACTT GTGGCGGCCAGCGGT-3'。根據(jù)MDV 814 株US2 基因序列（JF742597），設計鑒定重組粘粒及重組病毒引物US2R：5'-AGACATCCAGTCTATTACCTAGTTTTAA C-3'。引物均由吉林省庫美生物公司合成。

1.4 gp90 基因重組粘粒的構(gòu)建與鑒定 以克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重組質(zhì)粒pUC57-gp90為模板，利用引物gp90F/gp90R PCR 擴增獲得gp90基因。將純化后的gp90 基因經(jīng)EcoR I/ClaI 酶切后克隆入pCAGGS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-gp90。將該重組質(zhì)粒經(jīng)SalI/HindIII 酶切后獲得gp90 基因表達框架，將其經(jīng)SalI/HindIII 酶切后克隆入pEN?TR1 載體，獲得含有g(shù)p90 基因表達盒的重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后命名為pENTR1-gp90。將pEN?TR1-gp90 與重組粘粒p814-5US2KanccdB 均稀釋至300 ng/μL，按1 1的比例各取1 μL混合，加入2 μL的Gateway LR ClonaseTMII Enzyme Mix 進 行LR 反 應，反應條件為：25 ℃作用1 h，加入1 μL 蛋白酶K，置37 ℃作用10 min 終止反應，將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300 并涂布在氯霉素抗性LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，提取粘粒，PCR 鑒定構(gòu)建的重組粘粒所包含的814 株基因組的US2 基因中是否插入gp90 基因表達框架，并對PCR 產(chǎn)物測序鑒定，鑒定正確的重組粘粒命名為p814-5-gp90。

1.5 表達gp90 基因的重組MDV 的拯救 利用試劑盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90 5 個重組粘粒，通過磷酸鈣法將5 個粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF 細胞，4 d～5 d 后，觀察轉(zhuǎn)染的細胞是否出現(xiàn)MDV 特異性蝕斑病變。出現(xiàn)蝕斑后在CEF 中連續(xù)傳20 代，收獲第5、10、15、20 代含病毒的細胞。利用試劑盒提取細胞總基因組DNA，同時設親本病毒814 株基因組DNA 對照，利用引物gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定，并測序鑒定。鑒定正確的重組病毒命名為r814-gp90。

1.6 重組MDV gp90 蛋白表達的檢測 將第20 代重組病毒r814-gp90 株與親本病毒814 株分別接種CEF，培養(yǎng)4 d～5 d 后經(jīng)顯微鏡觀察，比較病毒在感染細胞中產(chǎn)生的蝕斑，并以gp90 蛋白MAb（1 100）作為一抗，以鼠抗兔IgG-FITC（1 200）作為二抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定gp90 蛋白的表達。同時，以gp90 蛋白MAb（1 1 000）作為一抗，以IRDye-800 標記的羊抗兔IgG（1 10 000）作為二抗經(jīng)western blot 鑒定。以上試驗均以親本814 株接種的CEF 作陰性對照。

1.7 重組MDV 生長曲線的測定 將重組病毒r814-gp90 株和親本病毒814 株分別以100 個蝕斑形成單位（pfu）的劑量接種于48 孔板中的次代CEF，感染后每隔24 h 收集含有病毒的細胞，持續(xù)至感染后144 h。將各個時間點所收集的病毒接種CEF，測定各時間點病毒的pfu，繪制生長曲線，分析重組病毒r814-gp90株和親本病毒814株在CEF中的生長特性。

2 結(jié) 果

2.1 重組粘粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果 將PCR 擴增獲得的gp90 基因插入到pCAGGS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-gp90。通過酶切獲得gp90 基因表達盒，并將其克隆至pENTR1 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR1-gp90。通過LR反應，將gp90基因表達盒替換至重組粘粒p814-5KanccdB 中，構(gòu)建重組粘粒p814-5-gp90。將重組粘粒p814-5-gp90 利用gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，獲得的PCR產(chǎn)物長度為1 900 bp（圖1），測序結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物包含gp90 基因和gp90 基因表達盒下游polyA 序列。而陰性對照樣品（親本粘粒p814-5）無gp90 基因插入序列。以上結(jié)果表明，重組粘粒p814-5-gp90 正確構(gòu)建。

圖1 重組粘粒p814-5-gp90 的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 1 Amplification of recombinant fosmid p814-5-gp90 by PCR

2.2 重組MDV r814-gp90 的拯救及PCR 鑒定結(jié)果將p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90重組粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF，轉(zhuǎn)染后10 d 出現(xiàn)MDV 特異性蝕斑病變，初步證明經(jīng)拯救獲得了重組病毒r814-gp90。將拯救獲得的重組病毒在CEF 中連續(xù)傳20 代，提取第5、10、15、20 代r814-gp90 株基因組DNA，利用引物gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物長度為1 900 kb（圖2），測序結(jié)果顯示插入的gp90 基因表達框架序列與預期一致；而親本疫苗814 株基因組DNA 擴增結(jié)果為陰性。表明重組病毒r814-gp90 基因組中插入的gp90 基因序列正確，且其能夠穩(wěn)定存在。

圖2 不同代次重組病毒r814-gp90 株的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of different generation recombinant virus r814-gp90 by PCR

2.3 重組MDV r814-gp90 株的gp90 蛋白表達的鑒定結(jié)果 將獲得的第20 代重組病毒r814-gp90 株與親本病毒814 株分別接種CEF，4 d～5 d 后觀察比較病毒在感染細胞中產(chǎn)生的蝕斑可見，r814-gp90 株在CEF 中產(chǎn)生折光性增強的圓形細胞，有些變圓細胞連成葡萄串樣的蝕斑形態(tài)，與親本病毒814 株無明顯差異。利用IFA 檢測目的基因gp90 的表達，結(jié)果顯示，r814-gp90 株感染的細胞可見綠色熒光信號，而親本病毒814 株以及沒有接毒的對照細胞均無熒光（圖3）。Western blot 結(jié)果顯示，r814-gp90 株感染的細胞中可以檢測到90 ku 的目的蛋白條帶，與預期gp90 蛋白大小相符（圖4）。以上結(jié)果表明r814-gp90 株可以在感染細胞中表達gp90 蛋白。

圖3 重組病毒的IFA 鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of recombinant virus by IFA

圖4 重組病毒的western blot 鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of recombinant virus by western blot

2.4 重組病毒r814-gp90 株生長曲線的測定結(jié)果將重組病毒r814-gp90 株和親本病毒814 株分別以100 pfu 接種CEF，每24 h 收集細胞，利用CEF 測定病毒的PFU，并繪制病毒的生長曲線。結(jié)果顯示，重組病毒與親本病毒均在感染后120 h 病毒的滴度達到最高峰，分別為9.15×104pfu/mL 和9.74×104pfu/mL；各時間點r814-gp90 株的滴度與親本病毒無明顯差異（p>0.05）（圖5）。表明重組病毒r814-gp90 株在CEF 中的復制特性與親本病毒一致。

圖5 重組病毒在CEF 中生長曲線的測定Fig. 5 Replication kinetics curie of the recombinant virus in CEF

3 討 論

REV 是感染雞、鴨、火雞和其它禽類的一種免疫抑制性和致瘤性反轉(zhuǎn)錄病毒[1-2]。目前普遍是采用類似于禽白血病的凈化策略來防控RE，然而，在當前現(xiàn)地REV 感染陽性率如此高的情況下進行該病的凈化，難度非常大，而且凈化成本很高，費時耗力。因此，研制一種安全、有效的疫苗對于RE 的防控具有非常重要的意義。

REV 不僅能夠水平傳播，還能夠通過雞胚垂直傳播，在實際生產(chǎn)中其引起的癥狀不典型，檢測較為困難，容易被忽視，防控RE 有一定難度[12]。本研究將REV 的保護性抗原基因gp90 表達框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組中，構(gòu)建了表達gp90 蛋白的重組MDV r814-gp90。對該重組病毒進行外源蛋白表達、細胞病變以及復制特性分析顯示，r814-gp90 可以在CEF 中穩(wěn)定表達外源蛋白gp90；其在CEF 中產(chǎn)生的蝕斑病變以及復制能力與親本病毒814 株無顯著性差異。以上結(jié)果表明，r814-gp90 有望作為一種重組MDV 候選活載體疫苗用于RE 的預防。

近年來的研究表明，REV 的感染在我國具有較為廣泛的地理分布。REV 除自身致病外，其還可以引起動物機體的免疫抑制，導致機體對其它疾病的易感性增加，甚至造成免疫失敗現(xiàn)象[12]。REV 與其它病毒經(jīng)常發(fā)生混合感染，進一步增加了疾病的防控難度。多項研究顯示，REV 與MDV 的混合感染會發(fā)生協(xié)同致病作用，導致感染雞腫瘤的發(fā)生率升高；REV 與其它病毒的混合感染還會降低MDV 疫苗的免疫效果[9]。814 疫苗株作為一種血清1 型MDV 弱毒疫苗，具有良好的安全性和有效性，本研究采用該株病毒為載體構(gòu)建了表達REV 保護性抗原gp90 蛋白的重組MDV r814-gp90，也同樣有望用于MD 的預防。綜上所述，本研究構(gòu)建的重組MDV 和r814-gp90 有潛力作為一種候選二聯(lián)疫苗用于RE 與MD 的預防。