郭萍，劉洋，魏丹丹，萬臘根

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006）

侵襲性肺曲霉菌病 (Invasive Pulmonary Aspergillosis，IPA)的發(fā)病率近些年來呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢，其主要與目前大量廣譜抗菌藥物、腫瘤化療藥物、 器官移植術(shù)后的免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等廣泛使用有關(guān)，已經(jīng)逐漸成為影響患者生命安全的重要感染疾病[1]。 過往關(guān)于IPA 診斷相關(guān)研究多集中于血液病患者，尤其是粒細(xì)胞缺乏患者[2]。隨著IPA 感染的逐漸播散，越來越多的診斷手段及相關(guān)指南中診斷標(biāo)準(zhǔn)的普及推廣，IPA 感染在非粒細(xì)胞缺乏患者中同樣存在高發(fā)，且多不像粒細(xì)胞缺乏患者癥狀典型，故常因不能及時有效的診斷而死亡率較高[3]。 傳統(tǒng)診斷方法主要以影像學(xué)檢查、痰涂片、痰培養(yǎng)及血清GM 試驗等手段，但這些技術(shù)手段在粒細(xì)胞缺乏患者上存在一定的敏感性和特異性，而在非粒細(xì)胞缺乏患者IPA 的診斷上存在較大的偏差性，造成了IPA 早期診斷困難，嚴(yán)重影響IPA 患者的預(yù)后[4]。

隨著人口的老齡化，COPD 患者已逐漸成為了社會中的主要群體部分。 而COPD 并發(fā)的IPA 感染則直接影響老年人的生命安全。 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM） 是存在于曲霉菌細(xì)胞壁表面的多糖抗原成分，可在早期感染釋放入血液及其他體液標(biāo)本中，可持續(xù)存在1～8 周[5]，因此，其常被看做是早期診斷IPA 感染的有效手段，但隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)血清GM 檢測常受到患者的細(xì)胞免疫，尤其是中性粒細(xì)胞免疫的限制，導(dǎo)致其在非粒細(xì)胞缺乏患者IPA 診斷價值十分有限。 支氣管肺泡灌洗液（BALF）是利用纖維支氣管鏡，對肺段和亞肺段進(jìn)行灌洗后，采集肺泡表面襯液所得。 而已有大量研究及IPA 感染診治共識表明，BALF-GM檢測對IPA 診斷具備較大的診斷價值，卻缺乏可靠的實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此GM 試驗在IPA 感染的診斷價值及其Cutoff 值的設(shè)定尚無定論。在COPD 患者并發(fā)IPA 感染診斷中的價值更無明確的研究，對其造成的假陽性和假陰性的影響因素也報道較少[6]。 因此本研究通過收集我院非粒細(xì)胞缺乏CO PD 患者的疑似 IPA 患者 BALF GM 試驗值， 探討B(tài)ALF-GM 試驗對非粒細(xì)胞缺乏患者并發(fā)IPA 的診斷價值，并對其造成的假陽性和假陰性的影響因素進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的疑似IPA COPD 患者59 例，排除了粒細(xì)胞缺乏、慢性肺曲霉病患者，進(jìn)行BALF-GM 試驗，并收集患者完整的臨床病例資料。 基于臨床及病理診斷，對59 例患者根據(jù)中國肺真菌病診斷和治療專家共識分為IPA 組和非 IPA 組。 IPA 組 11 例，其中確診 3 例，臨床診斷 8 例，非 IPA 組 48 例。 見圖1。

圖1 研究流程圖：患者的篩選和記錄

1.2 研究方法

1.2.1 IPA 的診斷 IPA 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007 年我國的肺真菌病診斷和治療專家共識及血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則 （第四次修訂版）[7]，分為確診、臨床診斷和擬診。 確診：同時具備危險因素、臨床特征、微生物學(xué)證據(jù)及組織病理學(xué)證據(jù)；臨床診斷：符合危險因素、臨床特征及微生物學(xué)證據(jù)， 包括特異性抗原檢測陽性或合格的痰標(biāo)本連續(xù)≥2 次分離到曲霉菌； 擬診：具備危險因素和臨床特征，但無微生物學(xué)證據(jù)者。 由于部分患者過早預(yù)防性使用抗真菌藥物治療，存在一定假陰性可能， 故本文我們將臨床診斷與擬診IPA 合并為一組。

1.2.2 GM 試驗 采用固相夾心法 ELISA 按照Platelia Aspergillus 試劑盒 (美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品)說明操作，分別將標(biāo)準(zhǔn)液、陽性對照液、陰性對照液及待測液各 300μl 和 100μl 處理液混勻，100℃水浴 3 分鐘，10000rpm/min 離心 10min， 取上清50μl 加入 96 孔板中，每孔中加入結(jié)合液 50μl 后，封板37℃水浴90min，洗板5 次后，加入顯色液200 μl，室溫避光 30min 后加入終止液 100μl。 放置酶標(biāo)儀450 nm 波長處讀取各孔的吸光度（OD）值。通過以下公式計算 GM 值：GM 值=OD 待測液/OD 標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 假陽性和假陰性的干擾因素 參照文獻(xiàn)方法[8]，對臨床資料回顧性分析，篩選出引起GM 檢測假陽性和假陰性的可能干擾因素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件，計量資料以±s 表示，采用T 檢驗或秩和檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗。 IPA 組和非IPA 組的血清GM 檢測值均為非正態(tài)分布，采用 Man-Whitney 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算BALF-GM 實驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。 選擇ROC 曲線下面積比較BALF-GM 試驗的不同臨界值，探索最佳臨界值。

2 結(jié)果

2.1 患者情況臨床特征及GM 結(jié)果分析 本研究中11 例IPA 患者及48 例非IPA 患者臨床特征如表1 所示。 在IPA 組中，肺部基礎(chǔ)疾病如肺癌、支氣管擴(kuò)張及肺結(jié)核等，肺外基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓、慢性肝炎及肝硬化、風(fēng)濕性疾病及實體器官腫瘤等及激素治療均與非IPA 組無顯著性差異。

表1 非粒細(xì)胞缺乏IPA 患者和非IPA 患者的臨床特征及基礎(chǔ)疾病

按宿主因素、臨床特征、微生物學(xué)及組織病理學(xué)檢查情況分類發(fā)現(xiàn)，IPA 組中確診患者共3 例（27.27%），GM 值中位數(shù)為 1.32（0.75～3.64）；臨床診斷+擬診患者 8 例 （72.73%），GM 值中位數(shù)為1.395（0.9～12.4）；非 IPA 患者 48 例，GM 值中位數(shù)為 0.65（0.50～3.94）。 其中確診組與臨床診斷+擬診組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。臨床診斷+擬診組與非IPA 組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

BALF 標(biāo)本下的GM 檢測最佳陽性界值 GM試驗不同臨界值的靈敏度、 特異度、PPV、NPV、AUC 及約登指數(shù)見表2。 其中臨界值為0.88 時對應(yīng)的約登指數(shù)最高，故設(shè)其為BALF-GM 試驗最佳臨界值。

由表2 及特征性ROC 曲線圖3 可知，BALFGM 試驗的最佳截斷值為0.8，敏感性和特異性分別為90.91%和85.42%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為55.56%和97.56%。 ROC 曲線下面積為0.882（標(biāo)準(zhǔn)誤差，0.036，95%置信區(qū)間 0.826～0.977），約登指數(shù)為0.763。

圖2 BALF-GM 實驗的受試者工作特征曲線

2.3 BALF 標(biāo)本GM 實驗假陽性和假陰性影響因素分析 以0.88 作為GM 實驗的最佳陽性界值，陽性患者共 18 例，假陽性 8 例，真陽性 10 例。 陰性患者共41 例，假陰性 1 例，真陰性 40 例。

在8 例假陽性患者中，2 例患者由隱球菌感染引起，3 例患者因使用半合成類青霉素引起，1 例假陰性結(jié)果因檢測前使用了抗真菌藥物伏立康唑造成。

3 討論

BALF 即支氣管肺泡灌洗液，是向支氣管肺泡內(nèi)注人生理鹽水并隨即吸出，收集肺泡表面的有效液體，其常作為臨床侵入性肺部疾病診斷的有效手段。 侵襲性肺曲霉菌感染因其感染隱匿、進(jìn)展快、難抑制和高死亡率等特點受到臨床重視[9]。 目前針對IPA 感染的診斷多主要集中于粒細(xì)胞缺乏感染患者的診斷，而在非粒細(xì)胞缺乏患者的診斷上尚存在較大的不足。 目前傳統(tǒng)檢測方法如痰培養(yǎng)、痰涂片及影像學(xué)檢查等面臨諸耗時長、敏感性差、特異性差等諸多缺點，而血清學(xué)檢測手段BALF-GM 試驗因其直接反映感染病灶而具備較高的特異性與敏感性被廣泛使用，尤其是在粒細(xì)胞缺乏患者并發(fā)IPA 上的診斷價值已被廣泛認(rèn)可[10]，并已納入了粒細(xì)胞缺乏患者的IPA 診斷微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，然而其在非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 的診斷中仍有較大爭議[11]。

表2 BALF-GM 試驗不同臨界值的檢測結(jié)果

血清GM 試驗因其曲霉菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞生長時才釋放入血液，常因細(xì)胞免疫而臨床使用受限，且容易因臨床藥物的使用及其他菌種的交叉感染而影響結(jié)果[12，13]。 相較而言，BLAF-GM 試驗對 I PA 診斷價值的報道越來越多，Meersseman 等[14]研究提示以BALF GM 吸光度指數(shù)＞0.5 為閾值，診斷敏感度為88%，特異度為87%。 Shin 等[15]研究也提示BALF GM 敏感度為85%。 本研究結(jié)果顯示，BALF GM 實驗的臨界值為0.88 時，敏感性為90.91%，特異性為85.42%，約登指數(shù)最大，提示BALF GM 實驗以0.88 為臨界值時具有最佳臨床應(yīng)用價值。 此時敏感度及特異度較高，ROC 曲線下面積為0.882。 本研究結(jié)果顯示非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 多發(fā)生在具有支氣管炎、 陳舊性肺結(jié)核等肺部基礎(chǔ)疾病，部分也存在激素治療史，但與非IPA 感染患者無明顯差異，表明BALF-GM 試驗診斷價值不受肺部基礎(chǔ)疾病的影響。 此外，在肺外基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓、慢性肝炎及肝硬化、風(fēng)濕性疾病及實體器官腫瘤等兩組也無顯著性差異，表明BALF-GM 試驗對COPD 患者IPA 感染具備較高的診斷價值。

以0.88 為臨界值， 對其中的8 例假陽性結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在假陽性結(jié)果中分為感染性因素和非感染性干擾因素，感染性因素由隱球菌交叉反應(yīng)引起，非感染性因素由使用半合成青霉素復(fù)合制劑引起，因此臨床上在面對假陽性結(jié)果時可從感染與非感染角度進(jìn)行分析，以提高GM 值在COPD 患者IPA 感染鑒別診斷的應(yīng)用價值。而1 例假陰性患者在檢測前使用了抗真菌藥物且有輸血史，GM 值明顯低于臨界值，但由于本次研究數(shù)據(jù)較少，差異不明顯，此結(jié)論需擴(kuò)大數(shù)據(jù)范圍再作分析。

綜上所述，本研究選擇BALF-GM 值為0.88 作為非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 感染診斷的最佳臨界值，ROC 曲線下面積最大，具有最佳臨床應(yīng)用價值，在此診斷條件下，GM 實驗假陽性多由感染性干擾因素和非感染性干擾因素引起， 對其區(qū)分有助于臨床診斷。