李曲文，黃夢(mèng)穎，謝方欽，林震宇，徐海濱，翁順太

（福建省疾病預(yù)防控制中心；福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院專(zhuān)業(yè)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，福建 福州350000）

隨著A+C 群流腦疫苗的普及， 流腦的發(fā)病率呈逐年下降趨勢(shì)，但流腦病例菌群呈一定程度多樣性變遷。 由于菌株在疫苗的選擇性壓力情況下，可使人群中存在腦膜炎奈瑟菌血清群和毒力發(fā)生一定的遺傳變遷，一旦發(fā)生血清群的轉(zhuǎn)換，則又有可能引起新的流腦大流行[1]。 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 通過(guò)測(cè)定多個(gè)管家基因的核苷酸序列，反應(yīng)細(xì)菌基因水平的遺傳學(xué)衍變[2]。 通過(guò)ST 分型可分析菌株進(jìn)化關(guān)系以及在判斷分離株是否屬高致病性克隆系等方面，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法分型的不足。本中通過(guò)MLST 分析我省分離的 3 例W135 菌株的 ST 型別， 以期為我省 W135流腦防控做一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 福建省2006-2019 年我科實(shí)驗(yàn)室分離的W135 群流腦病例菌株3 株。 生化鑒定情況: 梅里埃API NH 鑒定編碼為 5002， 鑒定率為99.9% Neisseria meningitidis; 梅里埃VITEK 2 NH卡鑒定編碼均為3634400000，鑒定率為98% Neisseria meningitidis。血清凝集實(shí)驗(yàn)為：3 株均與W135群凝集，而與其他血清群不凝集；常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果均為：CrgA 基因陽(yáng)性，Orf-2(A)基因陰性，SiaD(B)基因陰性，SiaD(C)基因陰性，SiaD(W135)基因陽(yáng)性。

1.2 主要儀器和試劑 Taq DNA 聚合酶、dNTP 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia 分裝品。 Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，Basic 電泳儀，PCR 擴(kuò)增儀為ABI 公司。 引物序列由福州鉑尚有限公司合成，見(jiàn)表1、表2。

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA 制備 腦膜炎奈瑟菌接種到血平板，37°C，5% CO2，24h 培養(yǎng)；刮取純的菌苔用于提取基因組DNA。

表1 PCR 擴(kuò)增引物

表2 PCR 測(cè)序引物

1.3.2 PCR 反應(yīng)條件 50.0μl 體系(純水 25.7μl，10x PCR 緩沖液 5.0μl，上游引物 5.0μl10μM 儲(chǔ)存濃度，1μM 終濃度，下游引物 5.0μl10μM 儲(chǔ)存濃度，1μM終濃度，dNTP 混合液 8.0μl，Taq 聚合酶 0.3μl 1.5個(gè)單位，DNA 模板 1μl 50ng 左右）PCR 擴(kuò)增條件：95°C，2min，（95°C，1min；Tm，1min；72°C，2min） ×30 cycels，72°C，5min(備注 Tm 根據(jù)不同因素設(shè)置）。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)及產(chǎn)物測(cè)序 PCR 產(chǎn)物編號(hào)送福州鉑尚公司測(cè)序（雙向）。

1.3.4 序列比對(duì)分析 樣本序列與MLST 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)。獲得ST 型。7 個(gè)位點(diǎn)均獲得序列號(hào)后，可以獲取菌株的ST 型別號(hào)和序列群編號(hào)。 然后經(jīng)BN 軟件聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果

2.1 7 個(gè)管家基因擴(kuò)增的電泳圖

圖1 Nm7 個(gè)管家基因擴(kuò)增結(jié)果

2.1 MLST 結(jié)果 通過(guò)對(duì)流腦的7 個(gè)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行DNA 測(cè)序，序列經(jīng) PubMLST 比對(duì)后，得出3 株W135 群腦膜炎奈瑟菌有兩株為ST11型，一株屬于ST4821 型。

圖2 MLST 結(jié)果

3 討論

腦膜炎奈瑟菌根據(jù)莢膜多糖的結(jié)構(gòu)特征分為A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、29E 等 12 個(gè)血清群，其中，A、B、C、W135、Y、X 群是目前主要流行的致病菌群。 腦膜炎奈瑟菌具有高度的遺傳多樣性和高頻基因重組的特征，且易出現(xiàn)自發(fā)突變和與外源性基因的整合重組，因而克隆群具有呈現(xiàn)多樣性特征。 MLST 是一種通過(guò)分析一般測(cè)定 6～10 個(gè)管家基因，內(nèi)部400～600 bp 核心片段的核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，根據(jù)發(fā)現(xiàn)時(shí)間的順序賦予每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列一個(gè)等位基因編號(hào)，組成等位基因譜即序列型(sequencetype，ST)。 1998 年由 Maiden等首次運(yùn)用于腦膜炎奈瑟菌的分型，MLST 可分析菌株的譜系關(guān)系，對(duì)發(fā)現(xiàn)常規(guī)的表型方法不能分型以及新出現(xiàn)的變異，具有明顯優(yōu)勢(shì)。 同時(shí)MLST 分型可用于國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)、溯源以及分子流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化等，從而準(zhǔn)確地研究菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系，以確定種屬[3]。

自2006 年福建省報(bào)道了我國(guó)首例W135 群之后在廣東、廣西、江蘇、安徽等省(自治區(qū))也相繼出現(xiàn)了W135 型腦膜炎奈瑟菌病例[4-6]。 我省在2019年又出現(xiàn)了W135 流腦病例，為了探討分析菌株之間的遺傳相關(guān)性，我們對(duì)3 株W135 菌株進(jìn)行MLS T 分型，其中兩株為 ST-11，一株為 ST-4821。 目前，全球流腦病例主要由7 個(gè)高致病性Nm 序列群的菌株引起， 分別是 ST1 序列群、ST5 序列群、ST8序列群、ST11 序列群、ST32 序列群、ST4144 序列群以及 ST4821 序列群[7，8]。 2005 年以前，中國(guó) W135群 Nm 均屬于 ST174；2006 年，ST11 和 ST4821 出現(xiàn)；2008 年，ST174 消失，ST11 成為優(yōu)勢(shì)克隆群；與ST4821 相比，ST11 與病人關(guān)系更緊密。 ST11 全球主要的高致病克隆系之一，該型曾在非洲引起大規(guī)模的暴發(fā)[9]，我省 2 例 W135 也屬于 ST11，提示我省病例菌株也屬于高致病性克隆系。 同時(shí)我省W135菌株也有一株屬于ST4821，ST-4821 在我國(guó)曾于2003 年出現(xiàn) ST-4821 型的 C 群流行，2015 年也出現(xiàn)了ST4821 的B 群的流行，朱兵清等學(xué)者發(fā)現(xiàn)ST 4821 的B 群與C 群具有相同的遺傳背景，可能是由于存在莢膜轉(zhuǎn)換[10-14]。 我省分離到的ST4821 的W135 群是我省首次分離到的ST 型別，也提示了我省存在W135 的遺傳多態(tài)性。

隨著流腦疫苗的接種，菌群不斷出現(xiàn)變遷，了解菌株之間的變異遺傳進(jìn)化關(guān)系，對(duì)于防控流腦的爆發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義[15，16]。 MLST 方法能為判斷流腦流行趨勢(shì)提供一定的分子流行病學(xué)依據(jù)。我省存在W135 群遺傳分子分型多態(tài)性，應(yīng)引起我省的重視以防范W135 流腦暴發(fā)和流行的風(fēng)險(xiǎn)。