薛妍，方曉峰

1蘇州市立醫(yī)院北區(qū)，江蘇蘇州215000；2上?？颇渭夹g(shù)咨詢有限公司

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，不僅可支持和協(xié)助代謝，同時(shí)在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、血腦屏障正常功能維持中起重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間通過“三方突觸”進(jìn)行神經(jīng)信息的傳遞和釋放、離子信號(hào)的傳導(dǎo)和整合；還可與神經(jīng)元、腦部毛細(xì)血管周細(xì)胞構(gòu)成“神經(jīng)血管單元”，參與神經(jīng)元活動(dòng)引起的局部毛細(xì)血管功能性充血[1]。腦部毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)血腦屏障發(fā)育和通透性維持有重要意義，在腦水腫形成中起重要作用。腦組織內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放、缺血缺氧和創(chuàng)傷等均可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，其中最主要的反應(yīng)為胞內(nèi)第二信使Ca2+濃度改變。胞內(nèi)Ca2+信號(hào)變化能在膠質(zhì)細(xì)胞間傳遞，從而影響中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的活動(dòng)。血管加壓素(VP)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種神經(jīng)腦垂體激素，多為精氨酸加壓素(AVP)。生理?xiàng)l件下，部分AVP可直接釋放至腦部作為神經(jīng)遞質(zhì)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)一系列的行為和認(rèn)知功能[2]。病理狀態(tài)下，中樞系統(tǒng)AVP異常升高，引起腦水腫加重、病情惡化。2018年1月—2019年4月，本研究觀察VP對(duì)大鼠大腦皮層1型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 SD大鼠10只，出生7 d，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。牛血清白蛋白、VP、HEPES緩沖液均購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM-F12培養(yǎng)基、新生牛血清、MEM氨基酸混合液(×50)購自美國GIBCO-BRL。熒光鈣探針Fura-2-五(乙酰氧基甲基)酯(Fura-2 AM)和鎂離子-fluo-4-五(乙酰氧基甲基)酯(Mag-fluo-4 AM)均購自美國Molecular Probes公司。Ca2+檢測(cè)系統(tǒng)購自美國PTI公司。Locke′s緩沖液：NaCl 140 mmol/L、KCl 4.5 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、D-葡萄糖5.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4；PBS緩沖液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L、KH2PO41.5 mmol/L、Na2HPO48 mmol/L，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。新生鼠用CO2處死，取大腦皮層，用無菌刀片切成小片，轉(zhuǎn)移到含0.25 mg/mL胰酶組織消化液中，于37 ℃消化15 min，以500 r/min離心2 min，去除上清液。加入PBS緩沖液，巴氏管吹打組織直至分散，以1 000 r/min離心10 min，去除上清液后重懸。濾膜過濾重懸液，去除未消化開的組織團(tuán)塊。將過濾得到的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min后去除上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)基中加入50 U/mL青霉素，50 μg/mL的鏈霉素。懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，種植密度為(3～5)×104個(gè)/cm2。細(xì)胞在37 ℃含5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～21 d。實(shí)驗(yàn)前，培養(yǎng)瓶在37 ℃以180 r/min搖床上搖2 h，之后換成冰冷的培養(yǎng)基，再搖16 h。收集黏附在培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞。

1.3 1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 采用免疫組化法。取載有星形膠質(zhì)細(xì)胞的玻片，置于4%多聚甲醛溶液(新鮮配制)中固定30 min，PBS清洗3次。清洗后玻片置于Triton X-100中通透10 min，再轉(zhuǎn)移至3%的BSA/PBS處理30 min以阻斷非特異性的抗體結(jié)合。玻片上細(xì)胞用抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的一抗(1∶80稀釋)于4 ℃孵育過夜，再用熒光素化的羊抗兔IgG二抗(1∶160稀釋)于室溫孵育1 h。用奧林巴斯IX 70型倒置顯微鏡觀察染色的細(xì)胞，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm。顯微鏡視野中觀察到綠色熒光的細(xì)胞即為被標(biāo)記的1型星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.4 VP干預(yù) 用Locke′s 緩沖液配制含0.1、1、10、100 nmol/L VP灌流液，用灌流泵將灌流液分別泵至灌流槽中刺激細(xì)胞，同時(shí)對(duì)細(xì)胞鈣信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣信號(hào)檢測(cè) 采用單熒光探針法[4]。將玻片上的星形膠質(zhì)細(xì)胞于37 ℃下與終濃度5 μmol/L的細(xì)胞質(zhì)鈣熒光探針(Fura-2 AM)孵育30 min，將玻片固定于灌流槽中，并將灌流槽放置于Ca2+測(cè)量/成像系統(tǒng)(PTI系統(tǒng))的熒光倒置顯微鏡載物臺(tái)上，選定待測(cè)細(xì)胞，啟動(dòng)激發(fā)光源激發(fā)探針Fura-2產(chǎn)生熒光，用Felix軟件實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)。激發(fā)光條件：340 nm/380 nm雙波長(zhǎng)交替激發(fā)(單色儀狹縫寬度為1 nm)，采集和檢測(cè)的發(fā)射光波長(zhǎng)為510 nm。數(shù)據(jù)采集軟件以熒光值F340/F380表示胞質(zhì)的鈣濃度。每次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)1個(gè)細(xì)胞，用Felix軟件持續(xù)測(cè)量、記錄選定細(xì)胞的熒光值變化，每秒記錄1個(gè)熒光值，根據(jù)熒光值繪制鈣反應(yīng)波形圖，波形包括無鈣反應(yīng)、單峰樣鈣升高、振蕩和高臺(tái)樣反應(yīng)。計(jì)算各種波形細(xì)胞所占比例。

1.6 細(xì)胞質(zhì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度同時(shí)檢測(cè) 采用雙熒光探針法。由于100 nmol/L VP刺激引起的鈣反應(yīng)發(fā)生率高，鈣峰明顯，故選擇該濃度刺激細(xì)胞[5]。將星形膠質(zhì)細(xì)胞于37 ℃同時(shí)與Fura-2 AM(終濃度5 μmol/L)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣熒光探針(Mag-fluo-4 AM，終濃度2 μmol/L)孵育45 min，選定細(xì)胞待測(cè)。本實(shí)驗(yàn)PTI系統(tǒng)僅支持雙通道激發(fā)光，故調(diào)整兩種熒光染料為單波長(zhǎng)光激發(fā)，F(xiàn)ura-2和Mag-fluo-4的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為340、488 nm，檢測(cè)兩種熒光染料發(fā)射光波長(zhǎng)均為510 nm。數(shù)據(jù)采集軟件分別以熒光值F340/F0、F488/F0表示胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣濃度。

2 結(jié)果

2.1 VP對(duì)1型星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)鈣信號(hào)的影響 經(jīng)0.1 nmol/L VP刺激后，92.3%細(xì)胞胞質(zhì)無鈣反應(yīng)，單峰樣鈣升高比例為7.7%；1 nmol/L VP刺激主要引起細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)鈣振蕩(43.8%)，無反應(yīng)細(xì)胞比例降低(31.2%)，并出現(xiàn)高臺(tái)樣鈣反應(yīng)(15.6%)；10 nmol/L VP刺激后，主要引起單峰樣鈣升高(50.9%)，高臺(tái)樣鈣反應(yīng)比例為41.8%；100 nmol/L VP刺激后，主要引起高臺(tái)樣鈣反應(yīng)(61.1%)，單峰樣鈣升高比例為35.2%。見表1。

表1 不同濃度VP對(duì)1型星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)鈣信號(hào)的影響[個(gè)(%)]

2.2 VP干預(yù)后細(xì)胞胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度的同步變化 100 nmol/L VP刺激前后胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度(熒光強(qiáng)度)分別為22 818±2 878、28 974±2 874；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度(熒光強(qiáng)度)分別為59 368±16 109、52 233±17 584。與100 nmol/L VP刺激前比較，刺激后胞質(zhì)Ca2+濃度升高(P<0.05)，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度降低(P<0.05)。

3 討論

Ca2+在中樞神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通信中起到橋梁作用。機(jī)體內(nèi)源性激動(dòng)劑作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引起的鈣信號(hào)變化可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)鈣信號(hào)調(diào)控具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，VP能濃度依賴性地引起星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)鈣濃度升高，且對(duì)應(yīng)的鈣峰形態(tài)變化從無反應(yīng)、振蕩、單峰直至高臺(tái)樣反應(yīng)。生理狀態(tài)下，人體血液中的VP水平為10～500 pmol/L[6]。但預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 pmol/L VP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣信號(hào)無影響，而100 pmol/L也僅引起極少量細(xì)胞產(chǎn)生鈣反應(yīng)。其他研究結(jié)果表明，VP引起半數(shù)血管平滑肌細(xì)胞系產(chǎn)生鈣響應(yīng)的濃度，需達(dá)到生理濃度的100～1 000倍[7]；中樞神經(jīng)系統(tǒng)中VP的濃度可達(dá)到血液正常生理水平的1 000倍[8]，而濃度梯度從0.1～1 000 nmol/L(10倍濃度梯度)才能夠引起星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放[9]。因此，離體細(xì)胞試驗(yàn)中激動(dòng)劑VP的效應(yīng)濃度可能需要高于生理濃度，故本研究選擇0.1、1、10、100 nmol/L共4個(gè)濃度梯度，探討VP引起細(xì)胞鈣動(dòng)態(tài)變化的量—效關(guān)系。

中樞釋放VP的核心功能通過V型VP受體(VR)發(fā)揮作用。VR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，包括V1aR、V1bR、V2R三種亞型。其中偶聯(lián)V1aR和V1bR磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)，增加胞內(nèi)第二信使Ca2+濃度，進(jìn)而激活蛋白激酶C、鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ等下游信號(hào)通路；V2R主要通過cAMP信號(hào)通路激活蛋白激酶A[10，11]。V1aR、V1bR和V2R均存在膠質(zhì)細(xì)胞中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)V1型受體(V1aR和V1bR)。V1型受體在大鼠神經(jīng)突和室周器來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞及1、2型星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[12]。此外，V1aR和V1bR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)1型星形膠質(zhì)細(xì)胞具有腦區(qū)分布的差異性。用免疫印跡法研究V1R亞型在不同腦區(qū)表達(dá)的差異性，結(jié)果表明培養(yǎng)的大鼠海馬1型星形膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)V1bR亞型，而在培養(yǎng)的大鼠大腦皮層1型星形膠質(zhì)細(xì)胞中僅表達(dá)V1aR亞型，并無V1bR亞型表達(dá)[13]。因此，本研中VP可能作用于V1aR，激活三磷酸肌醇(IP3)信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。

星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于非興奮性細(xì)胞，胞內(nèi)的鈣信號(hào)變化主要通過兩種來源進(jìn)行調(diào)控，即胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫釋放。胞外鈣內(nèi)流的途徑主要分為三大類：電壓門控的鈣通道、受體門控的鈣通道和鈣庫控制的鈣通道；胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫有兩種鈣釋放通道，即IP3和蘭諾啶受體(RyR)通道，將Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中釋放出來。激動(dòng)劑引起的非興奮性細(xì)胞的鈣信號(hào)變化一般為鈣振蕩、單峰，或是雙相鈣反應(yīng)(一個(gè)單峰后面緊接著一個(gè)高臺(tái))[14]。鈣振蕩或單相鈣峰是由于激動(dòng)劑作用于細(xì)胞表面代謝型受體，激活胞內(nèi)IP3信號(hào)通路，誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫鈣釋放導(dǎo)致胞內(nèi)鈣濃度快速升高，該過程伴隨快速清除機(jī)制；而激動(dòng)劑引起細(xì)胞胞質(zhì)高臺(tái)樣的鈣濃度變化，通常需通過胞外鈣離子跨膜內(nèi)流的機(jī)制進(jìn)行維持和調(diào)節(jié)[13]。從本研究結(jié)果可知，VP作用于1型膠質(zhì)細(xì)胞后，濃度依賴性地出現(xiàn)振蕩、單峰直至高臺(tái)樣的鈣信號(hào)動(dòng)態(tài)變化?？梢娫趹?yīng)對(duì)外界刺激時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生鈣信號(hào)的復(fù)雜調(diào)控。從鈣反應(yīng)的波形可知，高濃度VP作用后，可能有兩種Ca2+來源途徑同時(shí)參與了1型星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+調(diào)控。激動(dòng)劑刺激后波形快速上升相應(yīng)為胞內(nèi)鈣庫Ca2+快速釋放，而波形緩慢下降至平臺(tái)相可能是胞質(zhì)Ca2+清除過程中伴隨著持續(xù)外Ca2+內(nèi)流。

本研究還發(fā)現(xiàn)，低濃度(1 nmol/L)VP刺激更易誘發(fā)出1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣振蕩。雖然培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞其效應(yīng)閾值應(yīng)在nmol/L水平，但預(yù)計(jì)機(jī)體生理狀態(tài)下VP誘導(dǎo)出鈣振蕩的水平很有可能在pmol/L水平。細(xì)胞鈣振蕩通常出現(xiàn)在生理量-效范圍的激動(dòng)劑作用時(shí)，其特點(diǎn)為細(xì)胞整體出現(xiàn)重復(fù)的振蕩波形。鈣振蕩可以分為質(zhì)膜上鈣通道周期性開放引起的(膜振蕩子)或是胞質(zhì)內(nèi)鈣庫引起的(胞質(zhì)振蕩子)兩類。鈣庫引起的振蕩包括IP3或RyR通道介導(dǎo)的鈣庫釋放或二者的協(xié)同作用。目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定至少有胞質(zhì)內(nèi)鈣庫(胞質(zhì)振蕩子)參與了膠質(zhì)細(xì)胞鈣振蕩的發(fā)生。雖然VP誘導(dǎo)出1型膠質(zhì)細(xì)胞鈣振蕩的波形與通常經(jīng)典的高頻率鈣振蕩不同，但這也表明星形膠質(zhì)細(xì)胞很有可能通過低頻率鈣振蕩這種頻率編碼機(jī)制產(chǎn)生、攜帶和傳遞特定的信息，比如星形膠質(zhì)細(xì)胞通過鈣振蕩調(diào)控其自身分泌神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸)的持續(xù)時(shí)間，頻率和過程。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞自身周期性鈣振蕩可產(chǎn)生鈣波，通過鈣波在大腦皮層細(xì)胞間持續(xù)傳遞，參與大腦皮層鈣信號(hào)的空間差異性調(diào)控[13]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣庫主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為最重要的胞內(nèi)動(dòng)態(tài)的鈣庫，是胞質(zhì)鈣離子的主要來源，同時(shí)也對(duì)鈣信號(hào)起緩沖作用[13]。本研究選用低親和力的鈣離子熒光探針Mag-fluo-4 AM和Fura-2 AM同時(shí)檢測(cè)VP刺激后1型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)的鈣變化，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣排放和胞質(zhì)Ca2+升高同時(shí)發(fā)生。表明1型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為胞內(nèi)鈣庫參與了細(xì)胞鈣離子的調(diào)控。

1、2型星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要類型，對(duì)比研究二者在VP作用下的鈣信號(hào)變化有重要意義。1 μmol/L VP能夠引起2型星形膠質(zhì)細(xì)胞高臺(tái)樣的鈣反應(yīng)，但是發(fā)生鈣反應(yīng)的細(xì)胞僅占所有監(jiān)測(cè)細(xì)胞總數(shù)一半左右[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，VP濃度僅在100 nmol/L就能引起1型星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生高臺(tái)樣的鈣反應(yīng)，且刺激后發(fā)生鈣反應(yīng)的細(xì)胞比例高達(dá)96.3%(其中高臺(tái)樣反應(yīng)的比例為61.1%，單峰樣鈣升高的比例為35.2%)。因此，1型星型膠質(zhì)細(xì)胞比2型星型膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外界VP的刺激更敏感。由于目前對(duì)2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣動(dòng)態(tài)研究較少，具體原因尚不明確。推測(cè)可能與兩類細(xì)胞亞群表達(dá)VP受體的亞型或細(xì)胞表面受體數(shù)目差異性有關(guān)。

綜上所述，神經(jīng)細(xì)胞分泌的VP可激活大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞表面VP受體，偶聯(lián)磷脂酰肌醇信號(hào)傳遞系統(tǒng)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，胞內(nèi)鈣離子濃度可能受質(zhì)膜上離子通道和細(xì)胞器鈣庫如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共同調(diào)控。星形膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)以Ca2+為第二信使，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路。