李治岐,萬里新,李曉丹,陶海云,王旸
1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000;2 南陽市中心醫(yī)院
大腸癌(CRC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,約占所有癌癥的10%[1],每年新發(fā)病例約100萬。目前主要依靠外科手術(shù)及放化療等常規(guī)手段治療,雖然早期發(fā)現(xiàn)的CRC患者中約90%可通過手術(shù)治愈,但由于CRC發(fā)病早期癥狀特異性不明,易發(fā)生漏診,發(fā)現(xiàn)時(shí)往往是中后期,多由于腫瘤轉(zhuǎn)移引起患者死亡[2],導(dǎo)致CRC的5年生存率低于50%[3]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程,表現(xiàn)為失去上皮細(xì)胞極性,無法與基底膜連接,遷移和侵襲能力增強(qiáng)。重組人抑制蛋白-2(PFN2)屬于一類小的G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,是肌動(dòng)蛋白聚合的調(diào)節(jié)劑[4]。研究發(fā)現(xiàn),PFN2在CRC中的表達(dá)低于對照,且PFN2的低表達(dá)與腫瘤患者不良預(yù)后相關(guān)[5]。PFN2蛋白能激活三磷酸隣脂酰肌醇(PIP3),阻斷PDK/AKT/mT-OR通路,從而達(dá)到降低腫瘤細(xì)胞生長、遷移侵襲及血管生成的能力[6],是治療癌癥的潛在標(biāo)靶,具有較強(qiáng)的研究價(jià)值。微小RNA(miRNA)是一組長度為20~24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過與靶基因3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合,抑制該基因mRNA的表達(dá),從而對細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[7]能力進(jìn)行調(diào)控。2018年10月—12月,我們擬通過數(shù)據(jù)庫的預(yù)測功能,尋找PFN2的上游miRNA,探討miRNA通過PFN2通路介導(dǎo)的EMT過程對CRC進(jìn)展的影響。
1.1 材料 收集2018年10月—12月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院行CRC手術(shù)的患者新鮮癌組織標(biāo)本20例份,經(jīng)病理診斷為CRC,患者無放化療史、不合并其他器官腫瘤,臨床病例資料完整。同時(shí)收集其對應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣20 mm,上切緣無瘤黏膜組織)20例份。標(biāo)本置于液氮中,存放于-80 ℃冰箱內(nèi)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均知情同意。人大腸癌(CRC)細(xì)胞系HCT116、HT29購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。細(xì)胞系HCT116、HT29和正常結(jié)直腸細(xì)胞系(FHC)按照說明常規(guī)保存在實(shí)驗(yàn)室中。將細(xì)胞在6孔或12孔板(BD Biosciences,F(xiàn)ranklin Lakes,NJ,美國)中培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。
1.2 上游靶miRNA的預(yù)測 應(yīng)用miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi )預(yù)測功能,輸入PFN2基因名查詢即可。
1.3 組織和細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。根據(jù)制造商的說明,使用TRIzol試劑(美國Invitrogen)和miRcute血清/血漿miRNA分離試劑盒(中國TIANGEN),從組織、細(xì)胞和血漿樣品中提取總RNA。使用miRNA cDNAs合成試劑盒(Applied Biologic Materials,Inc,Canada)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。應(yīng)用EvaGreen miRNAqRNA MasteMix試劑盒(加拿大Applied Biologic Materials公司)檢測miR-183-5p (5′-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU-3′)表達(dá),內(nèi)參為U6。miR-183-5p 正向引物:5′-CGCGTATGGCACTGGTAGAA-3′,反向引物:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6正向引物:5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相對表達(dá)量的計(jì)算方法采用2-ΔΔCT法。
1.4 組織和細(xì)胞中PFN2 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。對于mRNA,使用PrimeScript RT-PCR試劑盒(Takara,大連,中國)從總RNA中逆轉(zhuǎn)錄cDNA。通過SYBR Premix Ex TagTMⅡ(Takara,大連,中國),通過ABI 7500系統(tǒng)(Applied Biosystem),使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR,檢測組織和細(xì)胞中 PFN2 mRNA的表達(dá)。β-actin作為內(nèi)參。相對表達(dá)量的計(jì)算方法為2-ΔΔCT法。PFN2正向引物:5′-GCGGCCGCATGGCCGGTTGGCAGAGCTACG-3′,反向引物:5′-GGATCCTTACACATCAGACCTCCTCAG-3′;β-actin正向引物:5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′;反向引物:5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′,反向引物:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。PFN2 mRNA相對表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法。
1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 應(yīng)用CCK-8法。慢病毒miR-183-5p轉(zhuǎn)染前24 h,將對數(shù)生長的 HCT116、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)置于12孔板,分為mimics control組、miR-183-5p mimics組,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔,當(dāng)細(xì)胞融合度約為50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,miR-183-5p mimics組加入慢病毒miR-183-5p懸液,mimics control組不予干預(yù),37 ℃孵育。于12、24、48、72 h檢測細(xì)胞增殖情況。操作步驟依據(jù)試劑盒說明書,之后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測OD值,進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 慢病毒miR-183-5p轉(zhuǎn)染前24 h,將對數(shù)生長期的 HCT116、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)置于12孔板,分為mimics control組、miR-183-5p mimics組,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔,當(dāng)細(xì)胞融合度約為50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,miR-183-5p mimics組加入慢病毒miR-183-5p懸液,mimics control組不予干預(yù),37 ℃孵育。用200 μL移液器槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)皿中刮擦平行線,然后用 PBS洗滌并在無血清的DMEM中孵育。劃痕完成后48 h顯微鏡下拍攝,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism軟件系統(tǒng)。兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析。采用Spearman檢驗(yàn)對miR-183-5p和PFN2表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 CRC癌組織和癌旁組織中miR-183-5p、PFN2 mRNA表達(dá) CRC癌組織和癌旁組織中miR-183-5p的相對表達(dá)量分別為3.346±0.873、1.793±0.427,PFN2 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.369±0.025、1.853±0.266,癌組織和癌旁組織中miR-183-5p、PFN2 mRNA相對表達(dá)量比較,P均<0.05。
2.2 細(xì)胞系中miR-183-5p、PFN2 mRNA表達(dá) FHC、HCT116、HT29細(xì)胞系中miR-183-5p mRNA的相對表達(dá)量分別為0.475±0.012、1.382±0.009、0.983±0.006,與FHC相比,miR-183-5p mRNA在HCT116、HT29細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)。FHC、HCT116、HT29細(xì)胞系中PFN2 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.284±0.149、0.513±0.007、0.478±0.005,與FHC相比,PFN2 mRNA在HCT116、HT29細(xì)胞系中表達(dá)下降(P均<0.05)。
2.3 miR-183-5p和PFN2表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),miR-183-5p和PFN2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.398,P=0.042)。
2.4 miR-183-5p對HCT116、HT29細(xì)胞系增殖及遷移能力的影響 miR-183-5p對HCT116、HT29細(xì)胞系增殖的影響見表1、2。同時(shí)點(diǎn)miR-183-5p mimics組細(xì)胞增殖能力高于mimics control組。mimics control組HCT116、HT29細(xì)胞遷移數(shù)分別為(29.41±0.76)、(24.74±0.84)個(gè)/HP,miR-183-5p mimics組HCT116、HT29細(xì)胞遷移數(shù)分別為(72.02±2.63)、(66.69±2.23)個(gè)/HP,miR-183-5p mimics組同種細(xì)胞遷移數(shù)均高于mimics control組(P均<0.01)。
表1 兩組HCT116細(xì)胞系不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較
表2 兩組HT29細(xì)胞系不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較
盡管治療方案的不斷發(fā)展給CRC的治療帶來了希望,但仍沒有針對CRC晚期轉(zhuǎn)移后的有效治療方案。癌細(xì)胞遷移侵襲伴隨著復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),一般通過入侵淋巴管或者伴隨血液循環(huán)從原發(fā)部位擴(kuò)散至遠(yuǎn)端組織,形成繼發(fā)性腫瘤[8]。EMT是CRC轉(zhuǎn)移的重要一環(huán)。EMT的啟動(dòng)和發(fā)展涉及復(fù)雜的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子網(wǎng)絡(luò)之間的串?dāng)_,如Wnts、Notch、Smads、ERK-MAPK及PI3K-AKT通路等。表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞上皮極性喪失,向間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤性增強(qiáng)[9]。這些變化使腫瘤細(xì)胞能夠通過細(xì)胞外基質(zhì)遷移至淋巴/血液血管中,實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲增殖[10]。
肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分,在癌癥的轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[11],PFN2在頭頸癌(HNSC)中顯著上調(diào),通過激活A(yù)kt和GSK-3β的磷酸化降低β-catenin的表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲[6]。但在在口腔鱗癌及大腸癌中卻發(fā)現(xiàn)PFN2可抑制癌細(xì)胞的增殖與侵襲[12]。我們通過qRT-PCR觀察到大腸癌旁組織與癌組織相比,正常FHC細(xì)胞系與癌HCT116、HT29細(xì)胞系中PFN2均顯著下調(diào),說明PFN2蛋白表達(dá)下調(diào)與大腸癌的惡化相關(guān)。
研究表明,microRNA的失調(diào)調(diào)控了腫瘤微環(huán)境中炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá)[13],在CRC的進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽視的生物學(xué)功能,目前已成為調(diào)控癌癥進(jìn)展的重要方向[14]。研究發(fā)現(xiàn) miR-183-5p參與多種癌癥的進(jìn)程,如在肺癌中可通過調(diào)節(jié) PIK3CA起到抑癌的作用[15],在胃癌中可通過調(diào)控EEF2抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[16],但同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)miR-183-5p在非小細(xì)胞肺癌中可通過抑制可以抑制p53,并通過磷酸化激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長[17]。可見miR-183-5p在不同腫瘤中可調(diào)控不同的靶基因,生物作用差異大。本研究結(jié)果顯示,miR-183-5p在CRC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),表明miR-183-5p可能在CRC中起促癌作用。最后,我們將模擬物轉(zhuǎn)染HCT116和HT29細(xì)胞系控制miR-183-5p的表達(dá),通過qRT-PCR及Western blotting確定了miR-183-5p對PFN2的調(diào)控關(guān)系,最后通過CCK-8法和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-183-5p過表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和增殖能力,促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移。
綜上所述,miR-183-5p可促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移,其機(jī)制可能是靶向下調(diào)PFN2表達(dá)。