尹輝，夏迎晨，喻本桐，劉燕隔，查建華，劉寶治，胡智

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006；2南昌大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3武岡市人民醫(yī)院

食管鱗癌(ESCC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，診斷明確后多為腫瘤晚期[1]。中國(guó)是世界食管癌高發(fā)的國(guó)家，而ESCC約占食管癌患病總數(shù)的90%。縫隙連接蛋白43(Cx43)構(gòu)成的縫隙連接作為相鄰細(xì)胞間膜通道結(jié)構(gòu)，通過(guò)縫隙連接通信相鄰細(xì)胞進(jìn)行信息和能量傳遞，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡起調(diào)節(jié)作用[2]。內(nèi)皮素-1(ET-1)是一種可與G蛋白偶聯(lián)家族ETAR和ETBR兩種受體結(jié)合發(fā)揮作用的活性多肽[3]。我們采用免疫組化法檢測(cè)ESCC組織中Cx43和ET-1的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年12月—2014年12月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院行食管鱗癌根治手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)ESCC的病理標(biāo)本118例?；颊咝g(shù)前均未行放化療治療，男77例、女41例，年齡45～75(60±15)歲。腫瘤直徑≤3 cm 54例，>3 cm 64例；高分化型33例，中分化型40例，低分化型45例；浸潤(rùn)深度：T1+T2期68例，T3+T4期50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，未轉(zhuǎn)移70例。同時(shí)選取118例相應(yīng)癌旁正常組織(距離癌組織5 cm以上)標(biāo)本作為對(duì)照。本研究通過(guò)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊呋蚱浼覍俸炇鹬橥鈺?shū)。1.2 ESCC組織及癌旁正常組織中Cx43、ET-1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。離體標(biāo)本以10%中性甲醛固定，常規(guī)行石蠟包埋，切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，再梯度乙醇水化；室溫下3% H2O2-甲醇溶液中孵育15 min；微波進(jìn)行組織抗原修復(fù)后用PBS沖洗3 min×3次；滴加一抗4 ℃冰箱過(guò)夜；加入二抗室溫下孵育20 min后PBS沖洗3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；光鏡觀察。PBS溶液替代一抗作為空白對(duì)照，已知的陽(yáng)性切片標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照。Cx43染色判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]方法，在光鏡高倍鏡下，陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，顯示棕黃色。結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞率結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，以兩指標(biāo)得分的乘積判定，0～1分為-，2～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。其中-～+為低表達(dá)，++～+++為高表達(dá)。

ET-1染色評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]方法，ET-1陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)染色棕黃色或棕褐色者。結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞率結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，兩分?jǐn)?shù)相加<2分為-，2～3分為+，4～5分為++,6分為+++。其中-～+為低表達(dá)，++～+++為高表達(dá)。

1.3 隨訪 通過(guò)電話或門(mén)診方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為手術(shù)當(dāng)日起至末次隨訪時(shí)間或死亡，截至2014年12月1日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)，雙變量資料相關(guān)分析選擇Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)其差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及癌旁正常組織中Cx43、ET-1表達(dá)比較 ESCC組織中CX43表達(dá)-、+、++、+++分別為24、59、23、12例，Cx43高表達(dá)率為29.66%(35/118)；癌旁組織中CX43表達(dá)-、+、++、+++分別為12、44、34、28例，Cx43高表達(dá)率為52.54%(62/118)。ESCC組織中ET-1表達(dá)-、+、++、+++分別為18、37、41、22例，ET-1高表達(dá)率為53.38%(63/118)；癌旁組織中ET-1表達(dá)-、+、++、+++分別為34、46、25、13例，ET-1高表達(dá)率為32.00%(38/118)。癌旁正常組織及ESCC組織中Cx43、ET-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 Cx43、ET-1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系 CX43表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。ET-1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Cx43、ET-1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 ESCC組織中Cx43和ET-1蛋白表達(dá)的關(guān)系 ESCC組織中ET-1低表達(dá)者Cx43高表達(dá)22例，低表達(dá)33例；ET-1高表達(dá)者Cx43高表達(dá)13例，低表達(dá)50例，Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ESCC內(nèi)Cx43和ET-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.211，P<0.05)。

2.4 CX43和ET-1表達(dá)與食管鱗癌患者5年生存率的關(guān)系 納入生存分析的ESCC患者中ET-1低表達(dá)55例，高表達(dá)63例，整體失訪率分別為20.3%；納入生存分析的ESCC患者中Cx43低表達(dá)83例，高表達(dá)35例，整體失訪率分別為19.5%。Cx43高表達(dá)者5年生存率高于Cx43低表達(dá)者(χ2=8.852，P<0.05)；ET-1低表達(dá)者5年生存率高于ET-1高表達(dá)者(χ2=9.855，P<0.05)。

3 討論

Cx43是間隙連接蛋白(Cx)家族的主要成員之一，主要表達(dá)于心肌組織、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種組織，可作為縫隙連接結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)[6]。Cx43是一種抑癌基因，與惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，惡性腫瘤中Cx基因被抑制，常處于失活狀態(tài)，隨著Cx43表達(dá)下降和缺失，可造成連接通信功能減退，影響細(xì)胞間信號(hào)傳遞、增殖分化，從而導(dǎo)致人體內(nèi)環(huán)境紊亂，使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性演變[7,8]。研究顯示，通過(guò)恢復(fù)Cx43表達(dá)和重建功能性間隙連接通信，可在腫瘤治療方面起到明顯效果。除此以外，通過(guò)間隙連接通信從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)亦可能成為Cx腫瘤治療的方式之一[9]。高飛等[10]應(yīng)用免疫組化法發(fā)現(xiàn)，Cx43在骨肉瘤組織中的表達(dá)低于骨肉瘤旁正常組織。Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)Cx基因表達(dá)后可明顯抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤形成。李建玲等[12]利用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Cx43表達(dá)于胃癌和正常胃組織中，Cx43的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性率隨著分化程度下降而呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)，說(shuō)明Cx43低表達(dá)可能與胃癌發(fā)展演變存在一定關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中Cx43的高表達(dá)率(29.66%)低于癌旁正常食管組織(52.54%)，與上述結(jié)果基本一致。隨著食管鱗癌分化程度增加、浸潤(rùn)深度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Cx43在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈降低趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)118例食管鱗癌患者5年生存率的分析結(jié)果顯示，食管鱗癌中Cx43低表達(dá)的患者，其5年生存率低于Cx43高表達(dá)者。這均可進(jìn)一步證明Cx43的抑癌功能；Cx43表達(dá)異常，可引起間隙連接蛋白改變從而造成通信中斷，這可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探討研究，Cx43有望應(yīng)用于臨床診斷并可成為開(kāi)發(fā)特異性影響細(xì)胞間通信的化學(xué)工具和藥物治療靶點(diǎn)。

ET-1是21個(gè)氨基酸組成的具有血管收縮功能的生物活性多肽，主要由內(nèi)皮素細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及表皮細(xì)胞合成。人類(lèi)ET存在ET-1、ET-2、ET-3三種基因表達(dá)，加上ETAR和ETBR兩種內(nèi)皮素受體，統(tǒng)稱為內(nèi)皮素軸[13]。其中，ET-1生物學(xué)活性最強(qiáng)，在多個(gè)器官系統(tǒng)疾病及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是近年來(lái)研究熱點(diǎn)[14]。ET-1除了血管收縮功能外，還具有刺激多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，促進(jìn)某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[15]。本研究結(jié)果顯示，ET-1在食管鱗癌組織中的高表達(dá)率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Ishimoto等[16]結(jié)果相符。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ET-1表達(dá)與食管鱗癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。食管鱗癌中ET-1高表達(dá)者5年生存率低于ET-1低表達(dá)者，表明ET-1參與了食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移。ET-1可通過(guò)影響Cx43基因表達(dá)從而減弱細(xì)胞間縫隙連接，造成腫瘤細(xì)胞發(fā)展演變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cx43和ET-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明食管鱗癌組織中Cx43減少或缺失、ET-1過(guò)表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

總之，Cx43在食管鱗癌中呈低表達(dá)，ET-1呈高表達(dá)，檢測(cè)二者表達(dá)有助于食管鱗癌的病情判斷及預(yù)后評(píng)估。