劉會云,田穎瑞,睢建亮,王夢蕾,殷苗苗,王珍
1.邯鄲制藥股份有限公司,河北 邯鄲 056000;2.復旦大學 生命科學學院,上海 200030;3.河北工程大學 醫(yī)學院附屬醫(yī)院,河北 邯鄲 056000
中成藥有效成分復雜,藥效物質(zhì)基礎不明確,其質(zhì)量穩(wěn)定性與中藥材的品種、產(chǎn)地、加工方式,以及成藥的劑型和劑量、制劑加工工藝、制藥設備、質(zhì)量管理及控制方法、包裝材料等因素有密切關系。竇志華[1]提出中成藥最突出的問題是產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,不同廠家生產(chǎn)的同一產(chǎn)品,甚至是同一廠家不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。劉靜等[2]基于國家樣本抽驗工作,提出影響中成藥質(zhì)量和安全的主要問題是原料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝。
摩羅丹濃縮丸作為由18味中藥組成的大組方制劑,具有較好的臨床效果[3-5],其化學成分復雜,制劑工藝繁瑣,并且產(chǎn)生藥理活性的物質(zhì)基礎尚未明確;作為復方制劑,檢測其中任何一種成分均不能體現(xiàn)其整體質(zhì)量,中藥中所含化學成分的種類和數(shù)量能比較全面地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量[6-7],所以通過對比不同批次間樣本所含化學成分的種類和數(shù)量可以直接反映樣本的質(zhì)量穩(wěn)定性。液質(zhì)聯(lián)用技術是指液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術,適合復雜體系的成分分析,是目前復雜體系活性成分快速分離和鑒定的有力手段[8-10]。另外,主成分分析(PCA)在中藥材和中成藥的鑒別與質(zhì)量分析中應用也較為廣泛[11-13]。本研究利用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-QTOF-MS)技術對摩羅丹濃縮丸所含化學成分進行分析,并結合PCA,對樣本的質(zhì)量穩(wěn)定性進行評價。
Eksigent ekspert型超高效液相儀(AB Sciex公司);Triple TOF 5600型高分辨質(zhì)譜儀(AB Sciex公司);Heraeus Fresco17型離心機(Thermo Fisher Scientific公司);BSA124S-CW型天平(Sartorius公司);JXFSTPRP-24型研磨儀(上海凈信科技有限公司);明澈 D24 UV型純水儀(Merck Millipore公司);PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。
甲醇、乙腈、甲酸(LC-MS級,CNW Technologies公司);L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司,純度≥98%)。
摩羅丹濃縮丸共10個批次,生產(chǎn)批號分別為:00518072、00518073、00518074、00518077、00518084、00518086、00518088、00518089、00518090、00518097,由邯鄲制藥股份有限公司生產(chǎn)。
稱取100 mg摩羅丹濃縮丸粉末,加入500 μL含有內(nèi)標(L-2-氯苯丙氨酸)的提取液(80%甲醇,內(nèi)標質(zhì)量濃度1 μg·mL-1)渦旋混勻30 s;冰水浴中超聲處理1 h;將提取液在4 ℃,12 000 r·min-1(離心半徑為859 mm)離心10 min;取出上清液,即得供試溶液。
色譜條件:色譜柱為UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B);梯度洗脫(0~6.5 min,5%~30%B;6.5~12.5 min,30%~70%B;12.5~22 min,70%~100%B);柱溫為40 ℃。
質(zhì)譜條件:本實驗采用電噴霧離子源,霧化氣壓:377.24 kPa,輔助氣壓:377.24 kPa,氣簾氣壓:241.32 kPa,溫度:550 ℃,噴霧電壓:5500 V(正離子模式)或-4000 V(負離子模式)。質(zhì)譜儀在控制軟件控制下基于數(shù)據(jù)依賴型掃描(IDA)功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中,篩選出強度最強且>100的分子離子進行對應的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。轟擊能量:40 eV,碰撞能差:20 V,15張二級譜圖每50 ms。
2.3.1數(shù)據(jù)處理方法 將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入Progenesis QI軟件,進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作,通過一級質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級質(zhì)譜碎片信息及相應裂解規(guī)律匹配法,結合中藥數(shù)據(jù)庫及相關文獻對MS/MS數(shù)據(jù)峰進行物質(zhì)鑒定。
2.3.2PCA 本研究使用SIMCA V14.1軟件,對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換加中心化(CTR)格式化處理,然后進行自動建模分析。
在確定了供試溶液的制備方法和色譜分離條件后,通過參照相關文獻,本實驗對摩羅丹濃縮丸UPLC-QTOF-MS分析進行了方法學驗證,考察儀器穩(wěn)定性、內(nèi)標響應情況[6-7]。
2.4.1穩(wěn)定性 取10個不同批次的摩羅丹濃縮丸,按照2.1項制備方法平行制備得10個供試溶液,從這10個供試溶液中分別取出20 μL進行混合,得到質(zhì)控(QC)樣品,平行進行3次,得到3個QC樣品,分別為QC-001、QC-002、QC-003;按2.2項下分析方法分別進樣進行檢測,QC樣品的檢測是穿插在10個供試樣品檢測中間,并在檢測結束后按2.3.2項下分析方法對QC樣品進行PCA。
2.4.2內(nèi)標響應情況 對2.4.1項中所得3個QC樣品中內(nèi)標物L-2-氯苯丙氨酸按2.2項下分析方法進行檢測。
通過對3個QC樣品中內(nèi)標物L-2-氯苯丙氨酸進行測定,得到3個總離子流分圖譜,對這3個譜圖進行疊加處理,結果見圖1。
注:A.正離子模式;B.負離子模式;下同。圖1 QC樣品中內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸的總離子流分圖
由圖1可以看到,正負離子模式下,QC樣品中內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸在總離子流分圖中色譜峰的保留時間和響應強度重疊性較好,說明儀器在數(shù)據(jù)采集過程中的穩(wěn)定性較好。
內(nèi)標為外源引入的物質(zhì),QC樣品中內(nèi)標濃度相同,所以內(nèi)標的響應差異越小(RSD≤20%),說明系統(tǒng)越穩(wěn)定,數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。通過對QC樣品中內(nèi)標進行響應差異分析,得出內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸在QC樣品中正、負離子模式下響應差異RSD分別為14.3%和15.7%,均小于20%,說明本次實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,系統(tǒng)較穩(wěn)定。
3.2.1摩羅丹濃縮丸總離子流分圖分析 因QC樣品是由10個不同批次摩羅丹濃縮丸的供試品溶液混合得到的,為排除不同批次樣本所含化學成分的差異,在對摩羅丹濃縮丸中所含化學成分進行定性分析的研究中,選擇了QC樣品作為研究對象。由于方法學驗證結果良好,按2.2項下分析方法對QC-001樣品進行測定,得到總離子流分圖,結果見圖2。
圖2 摩羅丹濃縮丸QC樣品總離子流分圖
采用UPLC-QTOF-MS對摩羅丹濃縮丸樣品進行測定,得到摩羅丹濃縮丸QC-001樣品總離子流分圖,根據(jù)該總離子流分圖,按照2.3.1的數(shù)據(jù)處理方法,對總離子流分圖中色譜峰進行物質(zhì)鑒定。在正離子模式下,摩羅丹濃縮丸共鑒定出214種化學成分;負離子模式下,共鑒定出164種化學成分,正負離子模式下相同化學成分11種,所以摩羅丹濃縮丸中共鑒定出367種化學成分。
摩羅丹濃縮丸作為一個大處方制劑,所含化學成分較復雜,根據(jù)該藥品的質(zhì)量標準,僅有3項鑒別項和1項含量測定項,遠遠不足以反映藥品的質(zhì)量情況,這也是中藥在質(zhì)量控制方面的難點,利用UPLC-QTOF-MS技術快速一次性鑒定出該藥品中所含的367種化學成分,能夠較為全面地反映藥品的質(zhì)量情況。
根據(jù)中藥化學成分的結構類型,對鑒定出的化學成分進行進一步分類,摩羅丹濃縮丸中含有64種三萜類物質(zhì)、38種黃酮類物質(zhì)、33種生物堿類物質(zhì)、33種萜類物質(zhì)、12種糖和苷類物質(zhì)、10種有機酸及脂肪酸類物質(zhì)、9種苯丙素類物質(zhì)、4種氨基酸類及3種醌類物質(zhì)等,其中三萜類、黃酮類、生物堿類及萜類數(shù)量較多,文獻[14-15]表明,這幾個種類中含有很多抗炎、抗菌、抗氧化藥理作用的化學成分,通過對這些化學成分的進一步研究,能夠進一步了解該藥品的作用機理。
基于摩羅丹濃縮丸成分復雜多樣,為了能夠對其成分更加全面而系統(tǒng)的分析,筆者利用數(shù)據(jù)庫,包括中科院上海有機所化學數(shù)據(jù)庫(www.organchem. csdb.cn)、臺灣中醫(yī)藥資料庫(http://tcm.cmu. edu.tw/)、Google scholar、Medline、CNKI、PubMed,根據(jù)摩羅丹濃縮丸組方中的藥材,對這367種化學成分進行了藥材一般來源歸屬,具體藥材歸屬見表1。從表1可以看出,18味藥材中鑒定出的化學成分數(shù)量不盡相同,其中來自茵陳、玄參、三七和延胡索中的化學成分較多,均超過30種。
表1 摩羅丹濃縮丸中所含化合物藥材歸屬統(tǒng)計
3.2.2不同批次摩羅丹濃縮丸所含化學成分重復率分析 為了研究摩羅丹濃縮丸不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性,本研究通過UPLC-QTOF-MS對10個不同批次的摩羅丹濃縮丸供試品溶液進行分析,得到各個批次樣品的總離子流分色譜圖,對這10個圖譜進行了疊加處理,結果見圖3。
圖3 10個不同批次摩羅丹濃縮丸總離子流分疊加圖
從圖3中可以看出,正負離子模式下10個不同批次摩羅丹濃縮丸總離子流分圖能夠較好地重疊,從出峰時間和信號強度的重疊情況來看,樣本各批次間所含化學成分種類及含量上均較相似,說明摩羅丹濃縮丸樣本各批次質(zhì)量差異性較小,總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好。采用UPLC-QTOF-MS技術獲得藥品的總離子流分圖,能夠較全面地反映出藥品的整體質(zhì)量,該方法較穩(wěn)定,且可重復性高。
為了更清晰地應用UPLC-QTOF-MS技術來表達各批次間樣品所含化學成分種類的重復率,對各批樣品鑒定出的化學成分種類及數(shù)量進行了進一步分析,結果見表2~4。
表2 正離子模式下不同批次樣品所含化學成分重復率
表3 負離子模式下不同批次樣品所含化學成分重復率
表4 正負離子模式下不同批次樣品所含化學成分重復率
從表2~3可以看出,10個不同批次摩羅丹濃縮丸在正離子模式下鑒定出的化合物數(shù)量從193~209不等,不同批次樣品間共有化合物數(shù)量為185個,所含化學成分的平均重復率為90%;負離子模式下鑒定出的化合物數(shù)量從154~159不等,不同批次樣本間共有化合物數(shù)量為151個,所含化學成分的平均重復率達到96%。
從表4中可以看出,10個不同批次摩羅丹濃縮丸樣品鑒定出總化學成分數(shù)量差距較小,最少341個,最多359個,共有化學成分為325個,各批次間所含共有化學成分的平均重復率達到92%。從不同批次樣品所含化學成分種類的重復率角度來看,說明摩羅丹濃縮丸樣品各批次質(zhì)量差異性較小,質(zhì)量穩(wěn)定性較好。
3.2.3不同批次摩羅丹濃縮丸樣品PCA 為從整體上比較摩羅丹濃縮丸不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性,本研究按照2.3.2項下分析方法對10個批次的摩羅丹濃縮丸樣品數(shù)據(jù)進行了PCA,得到10個批次樣品PCA質(zhì)量得分散點分布圖和質(zhì)量得分一維分布圖,結果見圖4~5。
圖4 10個不同批次摩羅丹濃縮丸樣品(n=10)PCA質(zhì)量得分散點分布圖
圖4中橢圓代表95%置信區(qū)間,從圖4可以看出,在正離子模式下00518073批次樣品在第一主成分上與其他批次之間有分離趨勢,而00518072和00518089批次樣品在第二主成分上與其他批次之間有分離趨勢,其他批次均較集中。結合圖5樣品PCA質(zhì)量得分一維分布圖可以看出,除00518073批外,其他批次質(zhì)量小于2個標準差;在負離子模式下,從圖4中可以看出各批次之間分布較離散,但結合圖5發(fā)現(xiàn),負離子模式下所有批次質(zhì)量小于2個標準差;表明不同批次樣品之間差異較小,總體質(zhì)量較為穩(wěn)定。綜上所述,通過10個不同批次樣品數(shù)據(jù)的PCA得出,摩羅丹濃縮丸藥品總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好,個別批次間略有差異。利用UPLC-QTOF-MS技術,結合PCA方法,能夠從另一角度反映出藥品多批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性。
圖5 10個不同批次摩羅丹濃縮丸樣品PCA質(zhì)量得分一維分布圖
本研究利用UPLC-QTOF-MS技術對摩羅丹濃縮丸的化學成分進行測定,鑒定出其含有367種化學成分,其中三萜類、黃酮類、生物堿類及萜類數(shù)量較多,比較全面地反映了摩羅丹濃縮丸的藥效物質(zhì)基礎和質(zhì)量情況,同時也為下一步該藥品的藥理作用研究提供參考;另外,通過對比10個不同批次樣品所含化學成分的種類和數(shù)量,得出不同批次樣品所含化學成分的平均重復率達到92%,進一步結合PCA結果,利用UPLC-QTOF-MS技術對摩羅丹濃縮丸的整體質(zhì)量穩(wěn)定性進行了更加全面地評價,10個批次樣品除1個批次外的其他批次間的質(zhì)量偏差較小,證明該藥品的總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好,個別批次之間略有輕微差異。本研究將UPLC-QTOF-MS技術應用到中藥制劑的質(zhì)量評價中,應用性強、穩(wěn)定性高,為中藥制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性評價系統(tǒng)的建立提供了思路。