張航，許華山，劉超，文冰，趙文增

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管外科，河南 鄭州 450052)

熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)作為應(yīng)激蛋白在缺血等應(yīng)激狀態(tài)下能夠快速高表達(dá)，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，還可以從細(xì)胞內(nèi)釋放入血，通過Toll樣受體等促進(jìn)大量炎癥細(xì)胞因子釋放以及參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[1-5]，從而引起血管壁的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，在冠心病(coronary heart disease，CHD)的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。HSP70作為分子伴侶，可以抵抗細(xì)胞的凋亡，對(duì)抗細(xì)胞的氧化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能，從而提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受性，可保護(hù)胰島β細(xì)胞由于應(yīng)激導(dǎo)致的損害，避免凋亡。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者持續(xù)高血糖，抗氧化酶活性的降低以及抗氧化素的減少等導(dǎo)致HSP70的持續(xù)過度表達(dá)，從而影響HSP70的抗氧化能力[6-7]。高敏C-反應(yīng)蛋白(high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)是一種急性期蛋白，在全身炎癥和非特異性炎癥過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度高度相關(guān)，是CHD發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8-9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)hs-CRP與胰島素抵抗有密切關(guān)聯(lián)。目前，HSP70與CHD或T2DM具有相關(guān)性已逐漸被認(rèn)可[2,7,10-11]，然而多數(shù)研究只關(guān)注HSP70與CHD或T2DM的關(guān)系。本研究通過檢測(cè)CHD組、T2DM組、CHD合并T2DM組及健康對(duì)照組4組研究對(duì)象的外周血HSP70表達(dá)水平，并以hs-CRP表達(dá)水平作為對(duì)照，探討HSP70與CHD合并T2DM的關(guān)系以及HSP70水平與冠脈病變程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年12月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院擬診CHD并住院行冠狀動(dòng)脈造影(coronary angiography，CAG)檢查的患者300例，根據(jù)癥狀和CAG結(jié)果將患者分為4組，其中CHD組80例，T2DM組70例，CHD合并T2DM組90例以及對(duì)照組(非CHD非T2DM組)60例。所有研究對(duì)象及家屬均同意參與本研究，并知曉其相關(guān)試驗(yàn)?zāi)康摹⒀芯窟^程和臨床意義。本研究開展獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有相關(guān)研究患者入院后均經(jīng)過全面的體格檢查，行相關(guān)影像學(xué)檢查(胸片、心電圖和多普勒超聲心動(dòng)圖)以及完善血常規(guī)、血凝試驗(yàn)、肝腎功能、電解質(zhì)等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查，排除合并有惡性腫瘤、心臟瓣膜病、心肌病以及急慢性感染性疾病患者，患有嚴(yán)重肝腎功能不全以及心肺功能衰竭患者亦排除在外。T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)：依照中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)2010年制定的《中國2型糖尿病防治指南》進(jìn)行診斷，排除繼發(fā)性糖尿病和1型糖尿病。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照世界衛(wèi)生組織1979年制定的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)，以左冠狀動(dòng)脈主干、前降支、回旋支以及右冠狀動(dòng)脈中至少有1支血管狹窄程度≥50%判斷為有意義病變，同時(shí)并根據(jù)累及血管病變支數(shù)定義為單支病變、雙支病變和多支病變。CHD形態(tài)學(xué)分型：根據(jù)美國心臟病學(xué)會(huì)聯(lián)合美國心臟協(xié)會(huì)1988年制定標(biāo)準(zhǔn)分為A、B1、B2和C型病變。

1.2 Gensini積分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)制定的冠狀動(dòng)脈血管圖像分段評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及Gensini積分系統(tǒng)對(duì)每支病變血管狹窄程度的進(jìn)行定量分析。1分：狹窄<25%；2分：≥25%，<50%；4分：≥50%，<75%；8分：≥90%，<99%；32分：≥99%。然后按冠狀動(dòng)脈每個(gè)分支狹窄的得分分別乘以相應(yīng)系數(shù)，左主干病變：得分×5；左前降支病變：近段得分×2.5，中段得分×1.5，遠(yuǎn)段得分×1；對(duì)角支病變：第一對(duì)角支得分×1；第二對(duì)角支得分×0.5；左回旋支病變：近段得分×2.5，遠(yuǎn)段得分×1；RCA病變：近、中、遠(yuǎn)段得分×1；后降支得分×1；后側(cè)支得分×0.5。由兩位熟悉心臟病專業(yè)醫(yī)生分別獨(dú)立進(jìn)行相關(guān)得分以及系數(shù)的判定，最后計(jì)算出來的得分總和的平均數(shù)即為該患者的Gensini積分。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)在行CAG前空腹采集所有相關(guān)研究對(duì)象肘正中靜脈血5 mL，在離心機(jī)上以3 000 r·min-1離心15 min，然后取其上清液分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱待測(cè)。HSP70及hs-CRP水平采用酶聯(lián)免疫吸附法中的雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)。相關(guān)檢測(cè)試劑盒購自于武漢中美科技有限公司，試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照其操作說明書進(jìn)行操作。使用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的Mode1550型酶標(biāo)儀進(jìn)行全自動(dòng)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較4組研究對(duì)象性別、飲酒、吸煙、年齡、收縮壓、肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)、甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組研究對(duì)象體質(zhì)量指數(shù)、空腹血糖及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較，CHD組、T2DM組、CHD合并T2DM組體質(zhì)量指數(shù)均高于對(duì)照組，HDL-C低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T2DM組、CHD合并T2DM組空腹血糖高于CHD組和對(duì)照組(P<0.05)；T2DM組、CHD合并T2DM組間空腹血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CHD組、T2DM組、CHD合并T2DM組間體質(zhì)量指數(shù)、HDL-C兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組研究對(duì)象一般臨床資料比較

2.2 4組研究對(duì)象HSP70水平及hs-CRP水平比較單因素方差分析顯示，4組研究對(duì)象之間HSP70水平及hs-CRP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用SNK法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，與對(duì)照組比較，CHD組、T2DM組及CHD合并T2DM組HSP70水平及hs-CRP水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CHD組和T2DM組分別比較，CHD合并T2DM組HSP70水平及hs-CRP水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，CHD和T2DM在HSP70及hs-CRP升高方面有交互作用(F1=21.790，P1<0.001；F2=62.047，P2<0.001)。見表2。

表2 4組研究對(duì)象HSP70水平及hs-CRP水平比較

2.3 CHD組和CHD合并T2DM組HSP70水平與Gensini積分的關(guān)系與CHD組相比，CHD合并T2DM組冠脈Gensini積分更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSP70水平與Gensini積分在CHD組及CHD合并T2DM組均呈正相關(guān)，并且在CHD合并T2DM組相關(guān)性更好。見表3。

表3 CHD組和CHD合并T2DM組患者HSP70水平與 Gensini積分的關(guān)系

2.4 CHD合并T2DM組患者不同冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)HSP70水平與hs-CRP水平根據(jù)冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)將CHD合并T2DM組進(jìn)一步分成單支病變組、雙支病變組和多支病變組3組，單因素方差分析顯示，3組間HSP70水平及hs-CRP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，采用SNK法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，與單支病變組比較，多支病變組、雙支病變組HSP70水平及hs-CRP水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與雙支病變組比較，多支病變組HSP70水平及hs-CRP水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 CHD合并T2DM組患者不同冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)HSP70 水平與hs-CRP水平比較

2.5 CHD合并T2DM組患者不同冠狀動(dòng)脈病變類型HSP70水平與hs-CRP水平將CHD合并T2DM組患者依據(jù)冠狀動(dòng)脈病變類型進(jìn)一步分為A型組、B1型組、B2型組和C型組，單因素方差分析顯示，4組間HSP70水平及hs-CRP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，采用SNK法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，C型組HSP70水平及hs-CRP水平均高于A型組、B1型組及B2型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A型組、B1型組及B2型組3組之間HSP70水平及hs-CRP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 CHD合并T2DM組患者不同冠狀動(dòng)脈病變類型HSP70 水平與hs-CRP水平比較

2.6 CHD合并T2DM組患者HSP70水平與hs-CRP水平相關(guān)性分析對(duì)CHD合并T2DM組患者HSP70水平與hs-CRP水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明二者呈正相關(guān)(r=0.728，P<0.001)。

2.7 CHD合并T2DM的危險(xiǎn)因素分析首先將CHD合并T2DM作為因變量，然后將一般臨床資料、hs-CRP和HSP70作為自變量先進(jìn)行單因素logistic回歸分析(將對(duì)照組賦值為0，CHD合并T2DM組賦值為1)，最后將有意義的變量吸煙、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、WBC計(jì)數(shù)、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C和hs-CRP或HSP70一并納入多因素logistic回歸分析模型，結(jié)果顯示hs-CRP及HSP70水平升高是CHD合并T2DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表6、7。

表6 CHD合并T2DM單因素分析

表7 CHD合并T2DM多因素logistic回歸分析

3 討論

CHD發(fā)病機(jī)制是由多種危險(xiǎn)因素共同作用的，尤其炎癥和免疫反應(yīng)在CHD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著決定性作用。HSP70優(yōu)先表達(dá)于循環(huán)系統(tǒng)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮組織和動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)過度表達(dá)。對(duì)于HSP70在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的研究目前意見不統(tǒng)一，有研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)HSP70作為保護(hù)性蛋白可以抵抗動(dòng)脈粥樣硬化[12-13]。然而，另外一部分研究認(rèn)為細(xì)胞外HSP70與細(xì)胞內(nèi)HSP70的作用可能有所不同，大量基礎(chǔ)及臨床研究顯示細(xì)胞外HSP70加重炎癥反應(yīng)并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。細(xì)胞外HSP70可通過Toll樣受體等介導(dǎo)激活核因子-κB，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)，比如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的釋放，并通過增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)和分泌，增強(qiáng)單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的能力[14-15]。本研究證實(shí)，CHD患者以及CHD合并T2DM患者中血清hs-CRP及HSP70水平均較對(duì)照組高。hs-CRP目前作為反映體內(nèi)炎癥反應(yīng)的一種客觀指標(biāo)，能準(zhǔn)確反映冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)狀態(tài)，提示HSP70可能也參與了CHD的炎癥發(fā)生和發(fā)展過程。T2DM發(fā)病機(jī)制和胰島素抵抗密切相關(guān)，也有研究認(rèn)為它是一種慢性低度炎癥反應(yīng)疾病。本研究結(jié)果顯示T2DM患者和T2DM合并CHD患者外周血hs-CRP及HSP70水平均高于對(duì)照組，hs-CRP與胰島素抵抗密切關(guān)聯(lián)，重要的是胰島素抵抗被作為是高血糖和動(dòng)脈粥樣硬化共同發(fā)病的生化代謝和基因遺傳機(jī)制之一，提示HSP70對(duì)T2DM的發(fā)病過程具有重要作用，這和Nakhjavani等[7]研究結(jié)果相一致，他們的研究證實(shí)了T2DM患者WBC計(jì)數(shù)、CRP和HSP70等指標(biāo)高于正常對(duì)照組。研究人員推測(cè)HSP70可能通過參與機(jī)體的免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)機(jī)制促進(jìn)了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。Yabunaka等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，T2DM患者體內(nèi)單核細(xì)胞中的HSP70水平明顯升高，而T2DM患者HSP70水平與年齡卻呈負(fù)相關(guān)。此外，Oglesbee等[17]研究酮癥酸中毒患者，發(fā)現(xiàn)在平穩(wěn)期時(shí)HSP70-2與血糖呈正相關(guān)。

本研究表明，HSP70在單獨(dú)CHD或T2DM患者中均發(fā)揮了重要作用，尤其在CHD合并T2DM患者血清HSP70水平更高。經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，CHD和T2DM在HSP70升高方面有交互作用。目前認(rèn)為，T2DM是心血管系統(tǒng)疾病的一個(gè)非常重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的高血糖刺激可以誘發(fā)心血管病變，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)而導(dǎo)致CHD。本研究對(duì)CHD合并T2DM患者外周血中HSP70水平與Gensini積分、hs-CRP水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明均呈正相關(guān)，而hs-CRP高表達(dá)明顯促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)廣泛得到臨床證實(shí)，說明HSP70的高表達(dá)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究在CHD合并T2DM患者Gensini積分較CHD患者Gensini積分高，說明可能是糖代謝異常導(dǎo)致HSP70水平升高進(jìn)一步加重血管炎癥反應(yīng)所致。Pirillo等[18]研究發(fā)現(xiàn)氧化型低密度脂蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP70，而HSP70可以提高細(xì)胞對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，并沒有保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化型低密度脂蛋白誘發(fā)的細(xì)胞毒性作用。Svensson等[19]研究認(rèn)為HSP70可能是氧化型低密度脂蛋白導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積與啟動(dòng)炎癥反應(yīng)之間的一個(gè)環(huán)節(jié)。在臨床工作中，合并有T2DM的CHD患者往往發(fā)病早，進(jìn)展快，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變重。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在CHD合并T2DM患者中病變多支數(shù)組與雙支數(shù)組、單支數(shù)組比較，HSP70表達(dá)水平明顯升高，而且C型冠狀動(dòng)脈病變類型患者HSP70表達(dá)水平明顯高于A型、B1型和B2型；logistic回歸分析顯示，hs-CRP及HSP70水平升高是CHD合并T2DM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Zhang等[11]研究證實(shí)，與正常對(duì)照組相比，HSP70表達(dá)水平在急性冠脈綜合征組以及穩(wěn)定型心絞痛組均明顯升高，并且在急性冠脈綜合征組最高，HSP70表達(dá)水平與急性冠脈綜合征的病情危險(xiǎn)嚴(yán)重程度呈高度正相關(guān)性。高表達(dá)水平HSP70和低表達(dá)水平HSP70抗體是急性冠脈綜合征患者發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，Zhu等[20]卻持相反觀點(diǎn)，他們認(rèn)為高表達(dá)水平HSP70可以減少冠狀動(dòng)脈粥樣硬化中膜厚度，從而降低CHD的危險(xiǎn)性。

綜上所述，本研究表明CHD和T2DM在HSP70升高方面有交互作用；HSP70水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)；與單純CHD患者相比，CHD合并T2DM患者HSP70水平更高，冠脈粥樣硬化程度更重。本研究對(duì)CHD合并T2DM患者外周血中HSP70進(jìn)行了初步探索，其相關(guān)作用機(jī)制依舊不清楚，尚需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步明確。