詹莉瓊，盧晏民，崔杰

作者單位：商丘市第一人民醫(yī)院，a呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，b腫瘤三科，河南 商丘476000

肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)位居首位，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的病理類型，我國NSCLC 的發(fā)病率也呈成年升高的趨勢，但早期診斷率并不高、多數(shù)病人就診時(shí)已達(dá)中晚期并錯過了最佳治療時(shí)機(jī)［1-2］。雖然近年來分子靶向藥物的不斷問世使NSCLC 病人的生存情況得到改善，但病人的長期生存率仍較低，亟需探尋新的治療靶點(diǎn)。miR-1269 是具有促癌特性的miR，已經(jīng)在肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中被證實(shí)能夠靶向抑癌基因FOXO1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲［3-4］。FOXO1在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌作用，能夠靶向抑制細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1的表達(dá)、增加細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞周期發(fā)生停滯［5-7］。但是，miR-1269 在NSCLC 病灶內(nèi)的變化及其與細(xì)胞周期的調(diào)控作用均未明確。為此，本研究具體分析了不同病理特征非小細(xì)胞肺癌中miR-1269 的表達(dá)及其對細(xì)胞周期的靶向調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年3月至2018年12月商丘市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的NSCLC 病灶和對應(yīng)的癌旁病灶 58 例，其中男性 32 例、女性 26 例，年齡（51.31±8.42）歲，年齡范圍為41～64 歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后病理診斷為NSCLC；（2）臨床資料完整；（3）術(shù)前未接受過放化療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞及試劑 miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒購自北京天根公司，肺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞資源中心，miR-1269的模擬物和抑制物購自上海吉瑪公司，蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 儀器 光定量PCR 儀購自Bio-rad 公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱和高速離心機(jī)購自Thermo公司，倒置顯微鏡購自Nikon公司，凝膠成像儀購自上海天能公司。

1.4 miR-1269表達(dá)量的檢測 取NSCLC病灶和癌旁病灶，采用miRNA 提取試劑盒進(jìn)行操作、提取組織中的miRNA，采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行操作、將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用miRNA熒光定量PCR 檢測試劑盒配置應(yīng)該定量PCR 反應(yīng)體系，對 cDNA 中的 miR-1269 及 U6 進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)曲線及循環(huán)閾值、以U6為內(nèi)參、計(jì)算miR-1269的表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A549細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿底面90%后用0.125%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后接種在培養(yǎng)板中并進(jìn)行分組處理?？瞻讓φ战M用DMEM 處理，NC 模擬物組轉(zhuǎn)染NC 模擬物、miR-1269模擬物組轉(zhuǎn)染miR-1269模擬物、NC抑制物組轉(zhuǎn)染NC 抑制物、miR-1269 抑制物組轉(zhuǎn)染miR-1269抑制物。

1.6 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的檢測 采用蛋白裂解液提取NSCLC病灶、癌旁病灶、轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中的蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測定總蛋白含量后取30～50μg總蛋白進(jìn)行檢測，將蛋白樣本加入預(yù)先配置好的聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后將凝膠中的蛋白樣本電轉(zhuǎn)移至NC 膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC 膜2 h，洗膜3 遍后用 CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體在4 ℃孵育NC膜過夜；第二天，洗膜3遍后用第二抗體在室溫孵育NC 膜2 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件錄入數(shù)據(jù)。兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，配對組間比較行配對t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌中miR-1269表達(dá)的變化 SCLC病灶中miR-1269的表達(dá)量明顯高于癌旁病灶（P＜0.05）；低未分化NSCLC 病灶中miR-1269 的表達(dá)量明顯高于高中分化NSCLC 病灶（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有脈管浸潤的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無脈管浸潤的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有胸膜侵犯的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無胸膜侵犯的NSCLC 病灶（P＜0.05）。見表1。

表1 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中miR-1269表達(dá)的變化

2.2 肺癌中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化及其與miR-1269 的相關(guān)性 NSCLC 病灶中 CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)量明顯高于癌旁病灶，p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯低于癌旁病灶（P＜0.05）；NSCLC病灶中miR-1269 的表達(dá)量與 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)量呈正相關(guān)，與p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。見圖1、表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的比較/

表2 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的比較/

注：配對t檢驗(yàn)，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

p21Cip1p27Kip1例數(shù)58 58組織來源癌旁NSCLC t 值P 值CyclinD1 0.58±0.10 0.31±0.07 15.527 0.000 CDK4 1.09±0.22 0.52±0.07 17.037 0.000 CDK6 0.73±0.16 0.25±0.05 22.318 0.000 0.52±0.08 0.70±0.13 8.282 0.000 0.58±0.09 0.85±0.15 6.895 0.000

圖1 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白的條帶圖 圖2 空白對照組、NC模擬物、miR-1269模擬物組細(xì)胞周期蛋白的條帶圖 圖3 空白對照組、NC抑制物組、miR-1269抑制物細(xì)胞周期蛋白的條帶圖

2.3 miR-1269 模擬物和抑制物對A549 細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) miR1269 模擬物組A549細(xì)胞中CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)量明顯高于空白對照組、NC 模擬物組，p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯低于空白對照組、NC 模擬物組（P＜0.05）；miR1269 抑制物組 A549 細(xì)胞中 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)量明顯低于空白對照組、NC 抑制物組，p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯高于空白對照組、NC抑制物組（P＜0.05）。見圖2，3；表3，4。

3 討論

miR-1269是具有促癌特性的miR-1269，已經(jīng)被證實(shí)在肝癌病人外周血及肝癌病灶內(nèi)均呈高表達(dá)的趨勢［8-9］；另有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-1269對肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有促進(jìn)作用［4］。在本研究中，NSCLC 病灶內(nèi)miR-1269 的表達(dá)量明顯升高，結(jié)合miR-1269在體外促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的活性分析認(rèn)為，miR-1269的高表達(dá)與NSCLC的發(fā)生有關(guān)且病灶內(nèi)高表達(dá)的miR-1269 能夠通過改變癌細(xì)胞的生物學(xué)行為來促進(jìn)腫瘤病理進(jìn)程的發(fā)展。本研究進(jìn)一步對不同病理特征NSCLC 病灶內(nèi)miR-1269 表達(dá)量的變化進(jìn)行了分析，低未分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管浸潤、有胸膜侵犯的NSCLC病灶中miR-1269的表達(dá)量明顯升高，說明NSCLC 病灶內(nèi)高表達(dá)的miR-1269能夠使腫瘤病理特征發(fā)生惡化，分化程度明顯降低且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、胸膜侵犯。

表3 miR-1269模擬物對A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)（n=5，）

表3 miR-1269模擬物對A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)（n=5，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC模擬物組比較，bP＜0.05，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

組別空白對照組NC 模擬物組miR-1269 模擬物組F 值P 值p27Kip1 0.66±0.13 0.71±0.12 0.32±0.05ab 19.985 0.000 CyclinD1 0.48±0.06 0.51±0.07 0.77±0.15ab 12.306 0.001 CDK4 0.85±0.14 0.89±0.15 1.21±0.19ab 8.157 0.006 CDK6 0.50±0.07 0.48±0.05 0.71±0.09ab 15.710 0.001 p21Cip1 0.73±0.14 0.77±0.08 0.45±0.05ab 16.000 0.000

表4 miR-1269抑制物對A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)（n=5，）

表4 miR-1269抑制物對A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)（n=5，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC模擬物組比較，bP＜0.05，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

組別空白對照組NC 抑制物組miR-1269 抑制物組F 值P 值p27Kip1 0.71±0.13 0.73±0.11 1.13±0.18ab 13.713 0.001 CyclinD1 0.71±0.12 0.77±0.11 0.32±0.05ab 30.879 0.000 CDK4 0.80±0.12 0.83±0.14 0.33±0.07ab 30.321 0.000 CDK6 0.73±0.12 0.79±0.13 0.41±0.08ab 16.605 0.000 p21Cip1 0.33±0.05 0.36±0.07 0.84±0.14ab 45.500 0.000

miRs 是一類不具備編碼蛋白質(zhì)功能的小分子RNA，通過結(jié)合靶基因mRNA 來使mRNA 降解或阻礙mRNA 翻譯，進(jìn)而改變靶基因表達(dá)水平并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)［10-11］。FOXO1 是 miR-1269 的靶基因之一，該基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控，一方面通過抑制cyclinD1 的表達(dá)并阻礙cyclinD1 與CDK4、CDK6的結(jié)合來使細(xì)胞周期停滯［12-13］，另一方面增加p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)并增強(qiáng)兩種分子對細(xì)胞周期的阻礙作用，兩方面共同起效并實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的抑制［14-15］。在本研究中，細(xì)胞周期正性調(diào)控分子cyclinD1、CDK4、CDK6在NSCLC病灶內(nèi)表達(dá)增多且與miR-1269 呈負(fù)相關(guān)，而細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1在 NSCLC 病灶內(nèi)表達(dá)減少且與 miR-1269呈正相關(guān)，說明細(xì)胞周期蛋白在NSCLC病灶內(nèi)發(fā)生顯著變化且這一變化可能受到miR-1269 的調(diào)控，miR-1269 通過靶向抑制FOXO1 的表達(dá)來削弱FOXO1對細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控作用，進(jìn)而使NSCLC病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)發(fā)生變化。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1269 在NSCLC 病灶內(nèi)對cyclinD1、CDK4、CDK6 及 p21Cip1、p27Kip1等細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控作用，本研究在以上臨床樣本研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549 后將miR-1269的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，分別實(shí)現(xiàn)miR-1269生物學(xué)效應(yīng)的增強(qiáng)及抑制，通過分析模擬物和抑制物對細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響來反應(yīng)miR-1269對細(xì)胞周期表達(dá)的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)染miR-1269模擬物后，A549細(xì)胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)明顯增多，而p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)明顯減少；在轉(zhuǎn)染miR-1269 抑制物后，A549 細(xì)胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)明顯減少，而p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)明顯增多。以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究表明，miR-1269能夠靶向調(diào)控肺癌細(xì)胞中多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期正性調(diào)控分子cyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)增多，而細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)減少。

綜上所述，miR-1269在NSCLC中呈顯著高表達(dá)趨勢且高表達(dá)的miR-1269 與NSCLC 病理特征的變化、細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化均密切相關(guān)；miR-1269 能夠在體外細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。今后可進(jìn)一步設(shè)計(jì)NSCLC荷瘤小鼠，抑制miR-1269表達(dá)后觀察腫瘤的生長情況，進(jìn)而探究抑制miR-1269在NSCLC治療中的潛在價(jià)值。