任 娟， 張希偉， 金花子*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.汪清縣動(dòng)物檢疫站，吉林 汪清 133201)

精子的發(fā)生過程又稱為生精過程。生精過程中精子凋亡機(jī)制被不恰當(dāng)激活或抑制，會(huì)過度凋亡導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在生精過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)均會(huì)伴隨著細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象以維持精子發(fā)生的動(dòng)態(tài)平衡，國內(nèi)外近年來研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)生精子凋亡的現(xiàn)象都會(huì)受到眾多內(nèi)在因素和外在因素的影響，其中有些影響因素會(huì)打破這種平衡，使精子在發(fā)生過程中細(xì)胞凋亡率增高。細(xì)胞死亡的方式有兩種，包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞壞死，長期以來被認(rèn)為是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。壞死細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細(xì)胞破裂。細(xì)胞凋亡又稱是程序性死亡，是有機(jī)體在自身控制下有序性死亡的方式，細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，控制細(xì)胞自主、有序性的死亡方式[1-2]，細(xì)胞在收到凋亡信號后，粘附細(xì)胞開始變成圓形，細(xì)胞核固縮、DNA斷裂，細(xì)胞核崩裂成染色質(zhì)片段，最后，細(xì)胞裂解為幾個(gè)囊泡，即凋亡小體，被周圍細(xì)胞吞噬。

細(xì)胞凋亡涉及的領(lǐng)域比較廣泛，在腫瘤疾病方面，細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞有著密不可分的關(guān)系。在衰老方面，隨著機(jī)體各個(gè)器官生長因子合成降低，機(jī)體骨骼肌、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫器官衰老等，都存在著細(xì)胞凋亡[3-5]。在內(nèi)分泌疾病方面，自身免疫性甲狀腺疾病、糖尿病心肌細(xì)胞凋亡和I類糖尿病都與細(xì)胞凋亡息息相關(guān)。在自身免疫疾病方面，機(jī)體自身免疫力降低，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列疾病，此時(shí)機(jī)體的樹突狀細(xì)胞、Th22細(xì)胞與細(xì)胞凋亡有著聯(lián)系。在發(fā)育生物學(xué)，細(xì)胞凋亡還扮演一個(gè)比較重要的角色，就是用來保護(hù)機(jī)體，以免受到有害細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凋亡在生長發(fā)育調(diào)控中的重要事件，主要是對生長和發(fā)育的調(diào)控，凋亡的控制是有利于機(jī)體的發(fā)育往正常的的方向發(fā)展。在精子形成的過程中會(huì)存在大量發(fā)育異常細(xì)胞，清除異常細(xì)胞是由細(xì)胞凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)。因此，細(xì)胞凋亡在精子發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，它可以更好的提高受精率，可進(jìn)一步提高胚胎質(zhì)量[6-8]。

1 細(xì)胞凋亡機(jī)制

細(xì)胞凋亡機(jī)制包括細(xì)胞上游誘導(dǎo)階段，細(xì)胞凋亡下游執(zhí)行階段和細(xì)胞凋亡降解階段[9-11]。最新的細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展，當(dāng)細(xì)胞凋亡程序開始后，Caspase(又稱半胱氨酸蛋白酶)會(huì)有一系列蛋白酶發(fā)生活化反應(yīng)，在活化反應(yīng)發(fā)生時(shí)，可以激活核內(nèi)的酸內(nèi)切酶，染色體會(huì)出現(xiàn)一系列降解反應(yīng)，Bcl-2家族和Caspase家族是主要調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡蛋白家族[12-14]。Bcl-2家族有兩個(gè)大的分類，分別是抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Caspase家族屬于細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)分子之一，包括啟動(dòng)階段和執(zhí)行階段2大類[15-16]，(圖1)所示[17-18]。

圖1 細(xì)胞凋亡信號途徑模式圖(引自Naoko I等,2011；Fuko M等,2012)

2 細(xì)胞凋亡的信號通路

細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號，凋亡調(diào)控分子間的相互作用，蛋白水解酶的活化(Caspase)，進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。根據(jù)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)階段的不同，可分為3條主要通路，線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及死亡受體通路。

2.1 線粒體通路

線粒體通路，即通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活Caspase[19]。線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。該通路為含BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員(Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等)與另外的結(jié)合在線粒體外膜或存在于胞漿的Bcl-2家族成員(Bax亞家族成員Bax，Bak等)相互作用，導(dǎo)致后者的寡聚并插入線粒體膜，從而引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，釋放細(xì)胞色素C(Cytc)和其他蛋白。Cytc的釋放是線粒體凋亡路徑的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的Cytc在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合形成多聚體，而后通過Apaf-1氨基端的Caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)募集胞質(zhì)中的Caspase-9前體，使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，被激活的Caspase-9能激活其它的Caspase如Caspase-3和Cspase-7等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子，如AIF，參與激活Caspase，誘導(dǎo)Cytc釋放和凋亡小體的形成。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，即由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失常引起的不以細(xì)胞膜或線粒體為靶點(diǎn)的凋亡信號觸發(fā)[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的主要場所，同時(shí)也是Ca2+的主要儲(chǔ)存庫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+平衡的破壞或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的過量積累是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中的關(guān)鍵，它們會(huì)誘導(dǎo)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Caspase-12的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)胞質(zhì)的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase-7可激活Caspase-12，而被激活的Caspase-12可進(jìn)一步激活Caspase-3從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

2.3 死亡受體通路

死亡受體凋亡通路是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一,接頭蛋白在路徑中發(fā)揮著重要作用[21]。死亡受體通路由各種外界因素作為細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)劑[22]，通過不同的信號傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號，引起細(xì)胞凋亡。死亡受體為一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因超家族。其胞外部分有一富含半胱氨酸的區(qū)域,胞質(zhì)區(qū)有一由同源氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，有蛋白水解功能，稱“死亡區(qū)域”(death domain：DD)。已知的死亡受體有5種，TFR-1(又稱CD120a或p55)，F(xiàn)as(CD95或Apo1)，DR3(死亡受體3，又稱Apo3，WSL-1，TRAMP，LARD)，DR4和DR5(Apo2，TRAIL-R2，TRICK2，KILLER)。前3種受體相應(yīng)的配體分別為TNF，F(xiàn)asL(CD95L)，Apo-3L(DR3L)，后2種均為Apo-2L(TRAIL)。例如配體FasL可首先誘導(dǎo)Fas三聚體化，三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使3個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD，在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，從而激活Caspase-8，進(jìn)而引起隨后的級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 精子凋亡檢測

3.1 Annexin V/PI雙染色法

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，但目前早期識別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂[23-24]，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。

Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有很強(qiáng)的抗凝血特性，和易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。

PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)有的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。2種細(xì)胞死亡方式間的差別是細(xì)胞凋亡在初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法[25]。

3.2 DNA ladder法

該方法為收集凋亡細(xì)胞，進(jìn)行洗滌裂解細(xì)胞，在對其進(jìn)行蛋白處理，DNA的沉淀，以及洗滌、溶解DNA，然后測定DNA的濃度，最后用2%瓊脂糖凝膠在80 V電壓下電泳2 h。凋亡細(xì)胞出現(xiàn)梯狀電泳條帶，最小的條帶為180～200 bp，其他的條帶為其整倍數(shù)大小。壞死細(xì)胞則出現(xiàn)彌散的電泳條帶，無清晰可見的條帶。正常細(xì)胞DNA基因條帶因分子量大，遷移距離短，故停留在加樣孔附近。

發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸酶被激活，染色體DNA鏈在核小體之間被切割，形成180～200個(gè)堿基或其整數(shù)倍的DNA片段，將這些DNA片段抽提出來進(jìn)行電泳，可得到DNA梯狀條帶(DNA)[26]，如圖2所示。

圖2 細(xì)胞凋亡的典型特征-DNA梯狀條帶(引自金愛花，等.2016)

3.3 DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法

DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法是指轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)。使用不需要模板的脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶，對DNA分子斷裂缺口中的3′-OH進(jìn)行原位標(biāo)記，凋亡細(xì)胞的核DNA斷裂后產(chǎn)生3′-OH末端，因此，可借助一種可觀測的標(biāo)記物如熒光素對單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，(圖3)[27]。

圖3 轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)原理圖(引自何玉婷，等.2019)

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50～300 kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200 bp核小體DNA多聚體。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯(nick translation)，使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

3.4 磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin-V法)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35～36 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidine Iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來，染色結(jié)果[28]中Annexin-V和PI二重染色時(shí),Annexin-V陽性(膜綠色)而PI陰性為凋亡表現(xiàn);Annexin-V(膜綠色)和PI(核紅色)均陽性為壞死表現(xiàn)。

4 哺乳動(dòng)物精子凋亡影響因素

哺乳動(dòng)物精子發(fā)生發(fā)育是個(gè)相對復(fù)雜的過程。在精子發(fā)生發(fā)育整個(gè)過程中，每個(gè)階段都有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。導(dǎo)致哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞凋亡的因素有很多，包括內(nèi)在因素(生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞)和外在因素(保存條件、光照和輻射、基因、空氣質(zhì)量、疾病和藥物、運(yùn)動(dòng)及其他因素)的影響[29-30]。

4.1 生精細(xì)胞和支持細(xì)胞

吳夏穎等[31]人采用不同產(chǎn)地的雷公藤多苷，檢測對大鼠睪丸組織及生精細(xì)胞凋亡的影響。3種不同產(chǎn)源的雷公藤多苷對睪丸生精細(xì)胞凋亡率有一定影響。龍治峰等[32]人研究大鼠隱睪復(fù)位固定術(shù)對生精細(xì)胞凋亡影響，隱睪內(nèi)生精細(xì)胞凋亡增加時(shí)，復(fù)位固定術(shù)能降低生精細(xì)胞凋亡。崔紅旺等[33]人用皮瓣重新建立兔陰囊，導(dǎo)致睪丸局部溫度升高，睪丸生精細(xì)胞凋亡就會(huì)增加。鄭程等人研究結(jié)果表明[34]，高脂高糖組大鼠的睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)量高于其他2組。買買提祖農(nóng)·買蘇爾等[35]人發(fā)現(xiàn)，異常黏液質(zhì)型陽痿病癥會(huì)在大鼠睪丸組織的模型發(fā)生一系列生理病理學(xué)改變，生精細(xì)胞異常凋亡，伊木薩克片的干預(yù)，能減少細(xì)胞的凋亡。郭炫佐等[36]人研究結(jié)果表明，當(dāng)模型組大鼠精子質(zhì)量降低時(shí)，生精細(xì)胞凋亡率及凋亡因子的表達(dá)明顯升高。西藥組(阿奇霉素組)精子質(zhì)量以及細(xì)胞凋亡率和凋亡因子表達(dá)均降低，中藥組(知柏地黃)對精子質(zhì)量改善明顯。

Przemyslaw S等[37]人研究結(jié)果表明，EMF誘導(dǎo)氧化和亞硝化應(yīng)激能介導(dǎo)DNA發(fā)生損傷，導(dǎo)致p53/p21依賴性細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。周圍環(huán)境中存在的電磁場，會(huì)誘導(dǎo)p53/p21介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，最后會(huì)直接損害雄性生殖力。

Song W Y等[38]人研究結(jié)果表明，miR-188-3p抑制劑導(dǎo)致小鼠生精細(xì)胞凋亡水平升高。Ren L[39]首次給藥后第45天，SiNPs增加了精子的畸形，降低了附睪精子的活力和濃度，SiNPs在睪丸中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并導(dǎo)致生精細(xì)胞的凋亡和壞死。

趙文紅等[40]人，采用不同濃度草甘膦對小鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)24 h，小鼠睪丸支持細(xì)胞會(huì)有不同程度縮小、脫落、甚至破碎，草甘膦能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖。

4.2 保存條件

當(dāng)新鮮精液由體溫快速降至10 ℃以下時(shí)，精子受到冷打擊，不可逆地失去活力而很快死亡，這種現(xiàn)象稱為“精子冷休克”。在保存精液時(shí)，常需降溫處理，尤其是從20 ℃以上急劇降至0 ℃時(shí)，由于冷刺激，會(huì)使精子遭受冷休克而喪失活力。這是因?yàn)榫觾?nèi)的縮醛磷脂融點(diǎn)較高，低溫下容易凝結(jié)，從而導(dǎo)致精子的代謝不能正常進(jìn)行而造成不可逆的冷休克死亡。王昕等[41]人研究結(jié)果表明，采用低溫冷凍環(huán)境保存豬精子，導(dǎo)致豬的精子細(xì)胞發(fā)生比較嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象。丁麗等[42]人用不同保護(hù)劑冷凍豬精子，冷凍保存會(huì)影響凋亡啟動(dòng)子在豬精子的表達(dá)，添加甘油、蔗糖、乳糖，可以有效抑制豬精子冷凍解凍造成的凋亡。Yadav H P等[43]人研究結(jié)果表明，CLC(膽固醇載環(huán)糊精)補(bǔ)充會(huì)減少精子冷凍后的細(xì)胞凋亡率。

4.3 疾病與藥物

石漢振等[44]人研究結(jié)果表明，除正常組之外，其他3組(少精子癥組、弱精子癥組、精子畸形組)精液里面都存在質(zhì)量差的精子，所以凋亡率高。李東航等[45]人，證實(shí)，對羥基苯甲酸丁酯具有細(xì)胞毒性，能降低精子活動(dòng)能力，促進(jìn)精子活性氧的生成和細(xì)胞凋亡的增加。

楊柳娜等[46]人研究表明，用不同濃度桔梗皂苷和0.31 mmol/L壬苯醇醚-9(N-9)，桔梗皂苷D(PD)對人精子有顯著的瞬間殺滅效應(yīng)，能引起精子晚期凋亡。

王鴻祥等[47]人試驗(yàn)結(jié)果表明，精漿Leptin水平，精子Omi蛋白含量與精子凋亡間存在顯著相關(guān)性，可能是促凋亡因子之一。許春爽等[48]人采用Percoll梯度離心法提取精子培養(yǎng)于含有不同濃度赤霉素的培養(yǎng)液中，再用流式細(xì)胞儀檢測精子凋亡情況，結(jié)果顯示赤霉素可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)降低精子運(yùn)動(dòng)力，從而促進(jìn)精子細(xì)胞凋亡。楊欣等[49]人采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)法對精子DNA的完整性進(jìn)行檢測，通過對比使用生精合劑先后的精子凋亡率，顯示生精合劑能提高不育男子的精子濃度和活力(P<0.05)且可顯著降低不育男性精子凋亡率(P<0.05)?？靛\祥等[50]人研究發(fā)現(xiàn)25～100 μg/mL HBs可誘發(fā)精子胞膜磷酯酰絲氨酸外翻，胞內(nèi)Caspase-3、-8、-9激活和DNA損傷，從而致使人精子凋亡以影響精子的功能。黃建忠等[51]人實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)淋球菌感染主要損傷精子頸部，尾部缺損；治愈后，精子可發(fā)生停止于未成熟精子細(xì)胞及凋亡精子細(xì)胞增多，是影響男性生殖能力，造成不育的重要因素。馬曉萍等[52]人采用Western blot和免疫熒光分別檢測人精子DCXR蛋白的表達(dá)和定位，采用TUNEL法檢測精子凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解脲脲原體感染陽性導(dǎo)致精子DCXR蛋白表達(dá)和精子凋亡有明顯改善，精子DCXR蛋白的表達(dá)具有保護(hù)精子并減少精子凋亡率的作用。苗晶等[53]人分析發(fā)現(xiàn)，多糖不僅可以作為某些物質(zhì)的基本組分以及體內(nèi)的供能物質(zhì)還在細(xì)胞間的識別、細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，如刺五加多糖( acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)對人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株凋亡有誘導(dǎo)作用，且凋亡率與ASPS的濃度呈正相關(guān)。熊憲獻(xiàn)等[54]人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1.0%的復(fù)方中草藥對青腳麻雞脾臟發(fā)育、抗氧化性和細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用,而對細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用。魏文科[55]設(shè)計(jì)了不同濃度的HCPT作用于體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞的試驗(yàn)并通過形態(tài)學(xué)觀察生化特征的觀察及流式細(xì)胞儀檢測等方法證明HCPT可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4.4 環(huán)境與基因

葛平玉等[56]人通過對照試驗(yàn)，將FITC-AV/PI染色后的精子用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，并采用化學(xué)比色法對睪丸組織NOS含量進(jìn)行檢測，采用硝酸還原法對睪丸NO含量進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)表明汽油尾氣可導(dǎo)致大鼠精子凋亡率升高，精子凋亡率與睪丸組織NOS、NO含量正相關(guān)。

潘陽陽等[57]人研究結(jié)果顯示不同濃度的EGF(表皮生長因子)可以降低耗牛冷凍精子的細(xì)胞凋亡。石溢[58]提到LPS引起精子凋亡率顯著降低，L-聚組氨酸與TLR4結(jié)合，阻斷LPS誘導(dǎo)精子凋亡途徑，可以降低精子凋亡。王桐生等[59]人通過組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)檢查在文章中討論得出，p73基因調(diào)控精子的發(fā)生及成熟，影響雄性生殖能力，p73基因有2種具有不同功能的亞型(TAp73和ΔNp73)，不僅影響生殖細(xì)胞與Sertoli細(xì)胞間的粘附與遷移，而且影響精子的凋亡。鄭立宏等人采用抽樣調(diào)查的方法，對有機(jī)磷農(nóng)藥接觸男性與非接觸男性進(jìn)行對照試驗(yàn)，應(yīng)用TUNEL法檢測精子凋亡，光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察凋亡精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接觸有機(jī)磷農(nóng)藥男性組精子凋亡率顯著增高，而且凋亡精子出現(xiàn)形態(tài)的異常。故得出長期接觸有機(jī)磷農(nóng)藥導(dǎo)致精子凋亡率升高，從而導(dǎo)致男性生育力下降的結(jié)論。

4.5 運(yùn)動(dòng)

張海英[60]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)作為一種特殊刺激,可造成一定的機(jī)體損傷,引起細(xì)胞壞死和凋亡。游泳運(yùn)動(dòng)可以改善高脂肪誘導(dǎo)的精子凋亡。劉樹超等[61]人提到，對大鼠進(jìn)行皮下注射尼古丁會(huì)出現(xiàn)精子異形和凋亡現(xiàn)象。葛平玉等[62]人試驗(yàn)結(jié)果表明，用汽車尾氣毒染大鼠睪丸組織，會(huì)導(dǎo)致精子凋亡率升高，精子的凋亡與睪丸組織的NO和一氧化氮合酶含量密切相關(guān)。Yang H等[63]人發(fā)現(xiàn)，X射線照射會(huì)導(dǎo)致小鼠GC1精子細(xì)胞凋亡。Rayborn M K等[64]人提到，辣椒素預(yù)處理顯著抑制生殖細(xì)胞死亡，辣椒素有抗凋亡活性，通過陰囊熱療引起的精原細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。韋秀霞等[65]人實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高膳食纖維可誘導(dǎo)雄性SD大鼠營養(yǎng)性肥胖，并引起脂代謝紊亂，睪丸組織結(jié)構(gòu)改變及睪丸組織細(xì)胞凋亡增加明顯。通過TUNEL檢測大鼠睪丸細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可明顯改善高膳食引起的脂代謝紊亂，同時(shí)通過降低炎癥因子TNF-α及其受體表達(dá)干預(yù)肥胖癥大鼠機(jī)體內(nèi)的精子凋亡。

5 展望

精子在哺乳動(dòng)物的繁殖中起重要的作用。目前，在整個(gè)精子發(fā)生過程中，對精子保護(hù)不夠完善，存在內(nèi)在和外在因素的影響，內(nèi)在和外界環(huán)境的變化導(dǎo)致精子無法馬上適應(yīng)，精子就會(huì)出現(xiàn)一系列反應(yīng)過程，此時(shí)就會(huì)有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生。現(xiàn)在動(dòng)物克隆技術(shù)、T細(xì)胞免疫激活、動(dòng)物胚胎移植和人工受精，內(nèi)在和外在因素，都有可能對精子質(zhì)量產(chǎn)生一些影響，會(huì)直接影響受精卵形成，大大降低動(dòng)物繁殖率。研究精子細(xì)胞凋亡影響因素，是為了更好完善內(nèi)在和外在環(huán)境條件，降低精子的凋亡率，改善精子質(zhì)量，進(jìn)一步提高受精卵質(zhì)量和受精率，為雄性不育的病理生理學(xué)分析、遺傳學(xué)病因解析及臨床診斷治療奠定堅(jiān)實(shí)的理論，對提高動(dòng)物的繁殖效率具有特別的意義。