劉海燕 錢(qián) 琪 鄭獻(xiàn)召 呂海東

焦作市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，焦作，454000，中國(guó)

挽救半暗帶和阻止梗死中心區(qū)的進(jìn)一步擴(kuò)大可以有效減輕缺血性腦梗死后神經(jīng)功能缺損，而梗死后治療性血管新生能及時(shí)恢復(fù)血供、重建側(cè)支循環(huán)，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。Slit/Robo 信號(hào)通路在軸突遷移［1］、白細(xì)胞募集［2-3］、肌細(xì)胞定位［4］等過(guò)程中都發(fā)揮排斥性或吸引性的導(dǎo)向作用，并在胚胎血管和腫瘤血管發(fā)生［5］中發(fā)揮重要作用，提示了Slit/Robo 信號(hào)通路對(duì)于機(jī)體可能存在一致的細(xì)胞導(dǎo)向作用［6］，并可能參與調(diào)控腦梗死后血管新生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞等的定向遷移。作為治療急性腦梗死的一類(lèi)新藥，尤瑞克林能通過(guò)內(nèi)皮釋放一氧化氮（nitric oxide，NO），擴(kuò)張細(xì)小動(dòng)脈，促進(jìn)血管新生。然而尤瑞克林是否在促血管新生過(guò)程中，作用于Slit/Robo 信號(hào)通路尚不清楚，故本課題結(jié)合急性腦梗死后Slit/Robo 的表達(dá)變化和尤瑞克林的促血管新生作用，探討腦梗死后血管新生過(guò)程中Slit/Robo 信號(hào)通路和尤瑞克林的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康SD 大鼠54 只，♂，體質(zhì)量：（250～300）g，由河南省動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)SCXK（豫）2010-0002）。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尤瑞克林組，再根據(jù)梗死后缺血時(shí)間分為1、3、7 d 三個(gè)亞組，每組6 只。尤瑞克林組給予尤瑞克林：17.5×10-3U·kg-1·d-1；模型組給予等體積生理鹽水。

1.2 藥物和試劑

尤瑞克林，由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供，粉針劑，規(guī)格為0.15 PNAU/支。Anti-Slit2 兔多抗、Anti-eNOS 兔多抗，均購(gòu)自Santa Cruz 公司。RT-PCR試劑盒，購(gòu)自Transgene 公司，引物由上海生工生物公司合成。

1.3 模型制備

采用改良Longa 法［7］建立永久性大腦中動(dòng)脈梗死動(dòng)物模型（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）。10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離至頸前肌肉，向左前方找到頸動(dòng)脈鞘，依次分離出頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）。夾閉ICA，結(jié)扎ECA 和CCA，在頸總動(dòng)脈分叉處下方再置一手術(shù)縫線并打活結(jié)，用于結(jié)扎線栓。在結(jié)扎線和活結(jié)之間剪一斜形小口，插入線栓，松開(kāi)動(dòng)脈夾，沿ICA 繼續(xù)插入線栓，直至輕插遇阻力且標(biāo)記處距分叉約2 mm 處，固定線栓至皮下，縫合皮膚。術(shù)后保暖直至麻醉蘇醒。術(shù)后觀察大鼠行為，并根據(jù)Longa［7］神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。納入標(biāo)準(zhǔn)：1～3 分，且排除其他因素。剔除標(biāo)準(zhǔn)：0 和4 分，并采用相同造模方法予以補(bǔ)充。假手術(shù)組不結(jié)扎不插線栓，余步驟相同。

1.4 Western-blot

提取總蛋白：剪碎腦組織后加入裂解液，勻漿后裂解30 min，4 ℃離心5 min，取上清。檢測(cè)蛋白濃度。取80 μL 樣品和20 μL 5×SDS 上樣緩沖液，混勻后加熱變性，灌膠上樣。每孔上樣量約20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，100 V 恒壓80 min。5%脫脂奶粉封閉2 小時(shí)，孵一抗，4℃過(guò)夜，TBST 漂洗3 次后孵二抗。漂洗后ECL 顯色，膠片掃描，以GAPDH 為內(nèi)參，用Bandscan5.0 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 RT-PCR

登陸Genbank 獲得Robo1 序列，以GAPDH 為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)特異性引物序列：Robo1：上游5′GG AGGAGTTCAGTGAAGAA3′，下游5′ TGGTGGCATC TAGGTTTTG3′（309 bp）；GAPDH：上游5′TCAACGGCA CAGTCAAGG 3′，下游5′ CAGATCCACAACGGATACA3′（569 bp）。腦組織勻漿后加入Trizol 和氯仿提取總RNA，全程避免RNase 污染，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)）。2%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析，計(jì)算DNA 條帶相對(duì)GAPDH 的灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MCAO 模型制作結(jié)果

造模前大鼠活動(dòng)自由。術(shù)后大鼠提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性（右側(cè)前肢屈曲不伸展）。身體偏向右側(cè)，或向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，側(cè)推抵抗力下降。提示大鼠左側(cè)大腦神經(jīng)功能缺損，造模成功。

2.2 Western 印跡結(jié)果

模型組和尤瑞克林組Slit2 蛋白在術(shù)后1～7 d 表達(dá)逐漸升高；模型組和尤瑞克林組各時(shí)間點(diǎn)Slit2 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均升高，尤瑞克林組各時(shí)間點(diǎn)Slit2 蛋白表達(dá)較模型組均升高（F=179.918，654.526，772.902，P＜0.05）（Tab.1）。模型組和尤瑞克林組內(nèi)皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在術(shù)后1～7 d 表達(dá)逐漸升高；模型組和尤瑞克林組各時(shí)間點(diǎn)eNOS 表達(dá)較假手術(shù)組均升高，尤瑞克林組各時(shí)間點(diǎn)eNOS 表達(dá)升高程度較模型組顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=137.500，328.011，1 923.814，P＜0.05）（Tab.2）。經(jīng)Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1 d、3 d、7 d Slit2 蛋白表達(dá)強(qiáng)度和eNOS 表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)（r=0.987，0.928，0.979，P＜0.01）（Fig.1）。

Tab.1 Expression of Slit2 in rat brain tissues at different time points（）

Tab.1 Expression of Slit2 in rat brain tissues at different time points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group，ΔP ＜0.05 vs the model group.

Tab.2 Expression of eNOS in rat brain tissues at different time points（）

Tab.2 Expression of eNOS in rat brain tissues at different time points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group.ΔP ＜0.05 vs the model group.

2.3 RT-PCR 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組和尤瑞克林組Robo1 mRNA 在各時(shí)間點(diǎn)均低于假手術(shù)大鼠模型，術(shù)后1 d表達(dá)明顯下降，之后逐漸升高，但仍較假手術(shù)組有所降低，7 d 仍未達(dá)到正常水平。與模型組比較，尤瑞克林組Robo1 mRNA 表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均高于模型組（χ2=1 213.567，704.513，35.110，P＜0.05）（Tab.3、Fig.2）。

Tab.3 Levels of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points（）

Tab.3 Levels of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group.ΔP ＜0.05 vs the model group score.

Fig.1 Relation chart of the expression of Slit2 and eNOS in rat brain tissues at different time points

Fig.2 Expression of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points

3 討論

Slit 蛋白作為神經(jīng)導(dǎo)向因子家族的一員，最先在果蠅中樞系統(tǒng)中線細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)，它在胚胎發(fā)育過(guò)程中，排斥性地導(dǎo)向軸突生長(zhǎng)錐的伸展方向，避免突觸跨越大腦中線［8］。作為智障相關(guān)因子，Slit 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在外周神經(jīng)損傷模型中，Slit蛋白及其受體Robo 和下游信號(hào)分子分泌增加，揭示了Slit 蛋白能促進(jìn)外周神經(jīng)軸突再生［9-11］。在腦缺血模型中，Altay 等［2］證實(shí)Slit2 蛋白能排斥腦缺血和腫瘤壞死因子所致的白細(xì)胞的募集，首個(gè)提出Slit2 蛋白通過(guò)抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。近期學(xué)者［9］通過(guò)小鼠模型發(fā)現(xiàn)成神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)Slit/Robo 通路遷移至腦中風(fēng)后的病灶，并有效促進(jìn)再生神經(jīng)。在血管新生方面，Slit2 能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［12-13］，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中重建血管網(wǎng)絡(luò)，Wang［6］和Jiang［14］等闡述了Slit/Robo 在腫瘤血管新生中的促進(jìn)作用，且利用Robo-N 能阻斷該信號(hào)通路的作用。并且Slit2 可能通過(guò)上調(diào)Robo1 和激活VEGFR2-ERK1/2 途徑來(lái)促進(jìn)視網(wǎng)膜血管生成［15］。在大腦組織的血管新生方面，Han［16］等發(fā)現(xiàn)，在其構(gòu)建的Slit2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，大腦血管密度和滲透性顯著增加。目前，Slit/Robo 信號(hào)通路在大腦梗死后血管新生過(guò)程中的具體作用機(jī)制［15］尚未明確。

本課題通過(guò)檢測(cè)Slit/Robo 信號(hào)通路主要分子，發(fā)現(xiàn)腦梗死發(fā)生后，Slit2 蛋白表達(dá)持續(xù)升高，說(shuō)明腦組織通過(guò)升高表達(dá)Slit2 蛋白，增強(qiáng)Slit/Robo 信號(hào)通路的作用，來(lái)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與eNOS 的表達(dá)高度正相關(guān)，從另一方面提示了Slit2 很可能協(xié)同eNOS 在血管新生的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Robo1 mRNA 在梗死后早期急劇下降，考慮與細(xì)胞受損和Robo1 介導(dǎo)炎性細(xì)胞滲透［17］相關(guān)，梗死后3 d，Robo1 mRNA 表達(dá)逐漸升高，在7 d 接近正常水平，但仍低于正常大鼠水平，提示在梗死發(fā)生后，Robo1 早期降低抑制炎癥反應(yīng)，而隨著大腦缺血缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)和炎性反應(yīng)的緩和，逐漸加強(qiáng)其在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管成管方面的作用，而這種作用正是升高的Slit2 蛋白介導(dǎo)的。

尤瑞克林是一種由人尿中提取的組織激肽原酶，能裂解激肽原為激肽，提高胞內(nèi)Ca2+的流動(dòng)，直接增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞上eNOS 的活性；同時(shí)也能超激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的受體［18］，并通過(guò)PI3K-Akt-GSK-3β［19］途徑提高eNOS活性，從而擴(kuò)張血管，促進(jìn)血管再生。本課題應(yīng)用尤瑞克林干預(yù)MCAO 模型大鼠，使eNOS 表達(dá)明顯升高，提示尤瑞克林明顯啟動(dòng)并增強(qiáng)了缺血部位的血管新生過(guò)程，從而提高該區(qū)的微血管密度，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成。在干預(yù)過(guò)程中，伴隨著eNOS 的升高，Slit2 及其受體的表達(dá)也明顯升高，于是，從另一方面提示了Slit2/Robo1 可能參與大鼠腦組織缺血后的血管新生過(guò)程。同時(shí)，也提示在復(fù)雜的血管新生過(guò)程中，尤瑞克林可能通過(guò)激活Slit/Robo 通路，發(fā)揮其促進(jìn)血管新生作用。