任政偉，王藝華，劉春燕，丁捷*，劉浩宇，陳美玲

(1.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，成都 610100；2.浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000)

泡椒豬肝營(yíng)養(yǎng)豐富，屬于低溫加工肉制品，且泡椒類(lèi)產(chǎn)品深受群眾喜愛(ài)。近年來(lái)，許多研究人員對(duì)泡椒豬肝的加工工藝進(jìn)行了大量的研究[1]。林坤等[2]對(duì)臘豬肝類(lèi)休閑食品的加工技術(shù)進(jìn)行了研究；盧雪松等[3]優(yōu)化了泡椒豬肝的生產(chǎn)工藝；崔瑞穎等[4]采用添加劑影響豬肝醬品質(zhì)。戚彪等[5]的研究表明微波殺菌與高溫殺菌相比較，品質(zhì)變化較小。Hanieh等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)超聲波結(jié)合水蒸氣的處理方法，其菌落總數(shù)可以減少3個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。Smith等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度超聲和抗菌劑的結(jié)合使用可以使病原菌的殺滅效果更好。Morild等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)高功率超聲結(jié)合處理后，豬皮和肉表面的病原菌明顯減少。隨著生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)泡椒類(lèi)產(chǎn)品的需求增大，而改善產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)已經(jīng)迫在眉睫[9-11]。

課題組前期將超聲波熱處理應(yīng)用于真空低溫烹飪領(lǐng)域獲得了良好的研究成果，尤其針對(duì)豬肝、鳳爪等經(jīng)過(guò)多次熱處理、極易造成其質(zhì)構(gòu)特性等感官狀態(tài)下降的原料，有效改良了其成品的質(zhì)構(gòu)特性[12,13]。在超聲波低溫真空技術(shù)加工肉制品的過(guò)程中，超聲波可同時(shí)起到殺菌和進(jìn)一步熟化的作用，但殺菌效果有限，無(wú)法完全殺死產(chǎn)品中耐熱的芽孢菌。因此，分離鑒定超聲波熱處理肉制品中腐敗菌，同時(shí)進(jìn)行天然成分的抑菌試驗(yàn)，對(duì)進(jìn)一步延長(zhǎng)該技術(shù)處理后肉制品的保質(zhì)期具有重要意義。目前，該類(lèi)型研究報(bào)道尚屬空白領(lǐng)域。本試驗(yàn)通過(guò)從超聲波低溫真空技術(shù)加工泡椒豬肝中，分離篩選獲得優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，確定種類(lèi)，并建立生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行天然抑菌物質(zhì)的篩選，為延長(zhǎng)超聲波輔助真空低溫烹飪產(chǎn)品的保質(zhì)期提供了理論依據(jù)，為后續(xù)復(fù)配天然抑菌劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肝、泡椒：購(gòu)于成都市龍泉驛區(qū)平安菜市場(chǎng)；培養(yǎng)基配方藥品：北京奧博星生物科技有限公司；可溶性淀粉：成都市科隆化工試劑廠；蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸石炭酸棉藍(lán)染液、酪蛋白、酪氨酸、結(jié)晶紫：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；茶多酚、醋酸、檸檬酸、乳酸：均為分析純，由成都鵬世達(dá)實(shí)驗(yàn)用品有限公司提供；過(guò)氧化氫、95%乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BH200型微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；YX-280A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；QYC-2102C型搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；202-3AB型電熱恒溫干燥箱 余姚市東方電工儀器廠；S-3C型pH計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；S1000型PCR擴(kuò)增儀、Gel-Doc-200型凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司；DY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；牛津杯(外徑 8 mm，內(nèi)徑6 mm，高 10 mm) 上海申賢恒溫設(shè)備廠；LRH-280 型生化培養(yǎng)箱 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

新鮮豬肝→切片(切成約0.3 cm×0.5 cm×0.2 cm厚的柳葉)→流水沖洗(1 h)→焯水(姜10 g，蔥20 g，料酒40 g，鹽1 g，100 ℃，20 min)→腌制液浸泡(12 h)→晾干→分裝(150 g/袋)→真空包裝→超聲波加熱處理→冷卻→成品。

1.3.2 菌株分離

將成品豬肝置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，培養(yǎng)72 h后稱(chēng)取25 g樣品放在225 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，80000 r/min 均質(zhì)2 min。用無(wú)菌吸管吸取1 mL菌液于9 mL無(wú)菌蒸餾水中，依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度大小的菌懸液。再分別吸取0.1 mL不同稀釋濃度下的菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，用于菌種的分離，在37 ℃下培養(yǎng)48 h后，挑選菌落形態(tài)大小不同的微生物進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

1.3.3.1 菌落及形態(tài)特征觀察

在無(wú)菌操作的條件下，將優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色等并做好記錄。

再對(duì)菌落按照革蘭氏染色的方法對(duì)菌株進(jìn)行染色，判斷其為革蘭氏陽(yáng)性菌還是陰性菌，并觀察單個(gè)菌種的形態(tài)。嚴(yán)謹(jǐn)觀察、描述、拍照、記錄。

1.3.3.2 生理生化試驗(yàn)

對(duì)分離出的主要腐敗菌根據(jù)其特性進(jìn)行了糖發(fā)酵、V.P、甲基紅、酶促、吲哚、明膠液化等生理生化試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3.3 16S rDNA菌種鑒定

將所得菌株送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列利用Blast程序，將所測(cè)定菌株的16S rDNA序列同GenBank中已提交的序列進(jìn)行Blast N分析和同源比對(duì)，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種，進(jìn)一步確定菌株的種屬性質(zhì)。

1.3.4 抑菌試驗(yàn)

1.3.4.1 供試菌種菌懸液的制備及培養(yǎng)

用高溫滅菌并冷卻的接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上分別刮少量活化的菌種，分別接種在不同的液體培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)48 h 后，置于4 ℃恒溫箱中備用。

1.3.4.2 抑菌劑濃度試驗(yàn)

通過(guò)固體平板擴(kuò)散法，分別考察乳酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、檸檬酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、醋酸溶液(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、茶多酚溶液(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)超聲波輔助熱處理豬肝中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離篩選

通過(guò)分離純化，獲得優(yōu)勢(shì)腐敗菌7種，分別將其編號(hào)為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。進(jìn)行革蘭氏染色后，將微生物置于顯微鏡的油鏡下觀察。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

對(duì)分離出的7種腐敗菌的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察鑒定，其形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1 主要腐敗菌的形態(tài)描述

2.3 生理生化和形態(tài)特征

對(duì)分離出的主要腐敗菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 主要腐敗菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分子鑒定結(jié)果及優(yōu)勢(shì)腐敗菌分析

對(duì)7種腐敗菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，并繪制生長(zhǎng)樹(shù)，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 主要腐敗菌發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)試驗(yàn)步驟，篩選得到7種主要腐敗菌，并得到各個(gè)菌種的16S rDNA序列。將各個(gè)菌種的16S rDNA序列在CNBI基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，獲得與菌種序列相似度最高的菌株，即初步認(rèn)定該菌株種類(lèi)。從中選取若干個(gè)相似性高的菌株序列，使用軟件，通過(guò)鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

7種腐敗菌的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 主要腐敗菌的測(cè)序結(jié)果

結(jié)合圖1和表3不難發(fā)現(xiàn)X4、X5與Bacillussubtilis同源性最高，X1與Paenibacilluspolymyxa同源性最高，X2與Pseudomonasfragi同源性最高，X6與Bacillussp.同源性最高。泡椒豬肝是低溫加工肉制品，低溫?zé)崽幚韺?duì)芽孢桿菌屬這種穩(wěn)定性好、耐氧化、耐擠壓、耐高溫的微生物較難完全殺滅，因此在后期的貯藏及運(yùn)輸過(guò)程中，一旦條件適宜或者受到污染，就會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖，造成食品的腐敗變質(zhì)[14]。莓實(shí)假單胞菌屬于假單胞菌屬，因其更適應(yīng)低溫環(huán)境，所以在泡椒豬肝加工過(guò)程中極易繁殖，是低溫加工肉制品的典型腐敗菌。高磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌是冷鮮雞腿肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。Wang Guangyu等[16]發(fā)現(xiàn)，在有氧冷藏條件下的黃羽雞肉中，假單胞菌屬是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，莓實(shí)假單胞菌對(duì)其具有較強(qiáng)的致腐能力。很多研究文獻(xiàn)表明，芽孢桿菌和假單胞菌是肉制品中的主要腐敗菌[17-19]。

2.5 固體平板擴(kuò)散法試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 不同濃度乳酸抑菌液對(duì)幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的乳酸對(duì)5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表4。

表4 不同濃度乳酸抑菌液對(duì)5種腐敗菌的抑制效果

由表4可知，乳酸對(duì)這5種腐敗菌均有一定的抑制作用，5種腐敗菌伴隨著乳酸抑菌劑濃度的增加，所對(duì)應(yīng)的抑菌圈均呈現(xiàn)由小變大的趨勢(shì)。對(duì)于X1，濃度為5%時(shí)抑菌圈大小約為1%濃度的1.5倍；對(duì)于X2，濃度為5%時(shí)抑菌圈大小約為1%濃度的1.93倍；對(duì)于X4，濃度為5%時(shí)抑菌圈大小約為1%濃度的1.5倍；對(duì)于X5，濃度為5%時(shí)抑菌圈大小約為1%濃度的1.7倍；對(duì)于X6，濃度為5%時(shí)抑菌圈大小約為1%濃度的1.9倍。根據(jù)抑菌圈平均值大小可以初步判斷其對(duì)5種腐敗菌的抑制效果都比較強(qiáng)。

2.5.2 不同濃度檸檬酸抑菌液對(duì)幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的檸檬酸對(duì)5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表5。

表5 不同濃度檸檬酸抑菌液對(duì)5種腐敗菌的抑制效果

由表5可知，檸檬酸對(duì)這5種腐敗菌都有一定的抑制作用，但效果不佳，且濃度較低時(shí)無(wú)法起到抑菌作用，尤其是在濃度為1%和2%時(shí)根本無(wú)法測(cè)量其抑菌圈大小，濃度提高后雖能測(cè)量出來(lái)抑菌圈大小，但效果依然不明顯。

2.5.3 不同濃度醋酸抑菌液對(duì)幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為0.5%～2.5%的醋酸對(duì)5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表6。

表6 不同濃度醋酸抑菌液對(duì)5種腐敗菌的抑制效果

由表6可知，醋酸對(duì)這5種腐敗菌都有十分強(qiáng)的抑制作用，在濃度較低時(shí)也可以看到明顯的抑菌圈。5種腐敗菌隨著醋酸濃度的增加，所對(duì)應(yīng)的抑菌圈均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。對(duì)于X1，濃度為2.5%時(shí)抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.3倍；對(duì)于X2，濃度為2.5%時(shí)抑菌圈大小約為0.5%濃度的3.4倍；對(duì)于X4，濃度為2.5%時(shí)抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.9倍；對(duì)于X5，濃度為2.5%時(shí)抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.7倍；對(duì)于X6，濃度2.5%時(shí)抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.7倍。根據(jù)抑菌圈平均值大小可以初步判斷其對(duì)5種腐敗菌的抑制效果都比較強(qiáng)。

2.5.4 不同濃度茶多酚抑菌液對(duì)幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的茶多酚對(duì)5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表7。

表7 不同濃度茶多酚抑菌液對(duì)5種腐敗菌的抑制效果

由表7可知，低濃度的茶多酚溶液對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌和兩種枯草芽孢桿菌的抑制作用均不明顯，甚至在濃度低時(shí)幾乎無(wú)抑制作用；因?yàn)椴瓒喾尤芤侯伾^深，抑菌圈不易觀察，因此在測(cè)量抑菌圈大小時(shí)容易造成誤差。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用十倍稀釋涂布法，篩選超聲波低溫真空技術(shù)加工的泡椒豬肝中的主要腐敗菌，對(duì)其進(jìn)行菌落、顯微鏡形態(tài)觀察以及16S rDNA片段擴(kuò)增和序列分析技術(shù)，最終確定多粘類(lèi)芽孢桿菌(X1)、莓實(shí)假單胞菌(X2)、3種枯草芽孢桿菌(X4、X5、X6)5種優(yōu)勢(shì)腐敗菌；通過(guò)平板擴(kuò)散法研究乳酸、醋酸、檸檬酸和茶多酚對(duì)5種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果，其中乳酸、醋酸這兩種抑菌劑對(duì)這5種腐敗菌均有較好的抑菌效果，且能明顯觀察并測(cè)量出抑菌圈大小；綜合分析確定乳酸、醋酸對(duì)5株腐敗菌的最低抑制濃度分別為2.0%、2.0%。

本次試驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)將為后面復(fù)配抑菌劑提供理論依據(jù)，為接下來(lái)復(fù)配抑菌劑的研究奠定基礎(chǔ)，篩選出能使泡椒豬肝貯藏更長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)配抑菌劑。在后續(xù)試驗(yàn)中添加使泡椒豬肝貯藏時(shí)間更長(zhǎng)，有效延長(zhǎng)泡椒豬肝的保質(zhì)期。