王 娜，劉 暢，薛 鵬，WANG Xiao，李玉坤，劉斯靜

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北省骨科生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.約翰·霍普金斯醫(yī)學(xué)院肌肉與骨骼研究中心，美國(guó) 馬里蘭 21212；3.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，河北 石家莊 050017)

成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，因此其分化過(guò)程存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。脂肪細(xì)胞占骨髓細(xì)胞的15%～70%，疾病狀態(tài)下(如骨質(zhì)疏松癥)或者隨著年齡增長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞數(shù)目增多，替代正常的其他類型細(xì)胞分化，如成骨細(xì)胞分化[1]。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)是胰島素信號(hào)通路的樞紐因子，可以通過(guò)激活下游通路的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，完成對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等功能的調(diào)節(jié)[2]。目前，關(guān)于IRS-1對(duì)成脂分化的作用尚存爭(zhēng)議。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除IRS-1基因可使成脂分化呈進(jìn)行性降低[3]。Kim等[4]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)IRS-1改善脂肪細(xì)胞脂質(zhì)儲(chǔ)存，即IRS-1促進(jìn)脂質(zhì)合成。具有盤狀同源區(qū)域結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)是一種調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖、分化等功能的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[5]。Byun等[6]研究表明，TAZ一方面通過(guò)共活化Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，另一方面通過(guò)結(jié)合過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)抑制成脂分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化。TAZ是否還有其他機(jī)制并不明確，且其所受調(diào)控的上游信號(hào)通路并未完全闡明[7]。本研究旨在探索IRS-1/TAZ信號(hào)通路調(diào)控BMSCs向成脂細(xì)胞分化的潛在機(jī)制，為糖尿病發(fā)病候選基因IRS-1參與調(diào)控骨代謝和脂肪代謝提供新依據(jù)。

1 材 料 與 方 法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)雌性未受孕SD(Sprague Dawley)大鼠15只用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；另4周齡SD大鼠9只用于BMSCs的原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證書號(hào) 1708080。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建 將15只3月齡SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組和去卵巢手術(shù)(ovariectomy，OVX)組，每組5只。去卵巢手術(shù)操作步驟：大鼠禁食禁水12 h后進(jìn)行麻醉，俯臥位定位大鼠卵巢，消毒手術(shù)部位，依次剪開皮膚、肌肉、筋膜，分離脂肪團(tuán)，手術(shù)結(jié)扎輸卵管，完整切除雙側(cè)卵巢，止血并逐層縫合。假手術(shù)組僅切除卵巢等體積脂肪組織，保留卵巢。術(shù)后3 d連續(xù)應(yīng)用抗生素預(yù)防感染。術(shù)后12周用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)及成脂分化 將4周齡SD大鼠CO2麻醉后處死，用75%乙醇浸泡5 min。在無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨，剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。細(xì)胞取出后，以5×106/cm2的密度接種于含12%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞達(dá)到80%融合后傳代，P3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM含12%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 g/L胰島素,500 mmol/L甲基異丁基黃酸鈉和1 μmol/L地塞米松)誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化。

1.2.3組織化學(xué)染色 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；酒精梯度脫水后石蠟包埋，制作4 μm石蠟，切片。將石蠟切片65 ℃烘干，二甲苯脫蠟，酒精梯度復(fù)水。采用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行染色。顯微鏡下對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.4免疫熒光分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；應(yīng)用8%明膠包埋，制作20 μm冰凍切片。將冰凍切片37 ℃烘干，浸泡于PBS液15 min，5% BSA封閉1 h，一抗孵育(抗圍脂滴蛋白，Sigma)，4 ℃，過(guò)夜；TBST清洗，熒光二抗孵育1 h，TBST清洗，封片。顯微鏡下對(duì)熒光標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 取SD大鼠股骨，將周圍組織剔除干凈，于液氮條件下研磨，加入RIPA裂解液，超聲破碎后離心，取上清液。根據(jù)IRS-1 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)操作步驟測(cè)定IRS-1濃度。

1.2.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)自行構(gòu)建IRS-1高表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-IRS-1)[8]。本研究構(gòu)建了分別用于敲除IRS-1和TAZ表達(dá)的質(zhì)粒，即嵌入可敲除IRS-1表達(dá)的小干擾RNA(SiIRS-1)的質(zhì)粒，以及嵌入可敲除TAZ表達(dá)的小干擾RNA(SiTAZ)的質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司)。應(yīng)用脂質(zhì)體3 000(Thermo)對(duì)BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組設(shè)置為“空白對(duì)照組”，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組作為“陰性對(duì)照組”。

1.2.7油紅O染色 將細(xì)胞接種至35 mm塑料培養(yǎng)皿中成脂誘導(dǎo)14 d后，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，蒸餾水清洗3次。將油紅O儲(chǔ)存液(0.5 g油紅O溶于100 mL異丙醇)與蒸餾水以3∶2的比例配置工作液，室溫放置10 min后過(guò)濾。應(yīng)用油紅O工作液室溫染色15 min。蒸餾水清洗3次后，顯微鏡下拍照。然后，應(yīng)用異丙醇對(duì)油紅O進(jìn)行脫色，加入等體積PBS液后放入通風(fēng)櫥，室溫，30 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀(520 nm)讀取其OD值。

1.2.8蛋白免疫印跡(Western blot) 將細(xì)胞接種至60 mm塑料培養(yǎng)皿中成脂誘導(dǎo)3 d后，利用RIPA裂解液提取蛋白。應(yīng)用12% SDS-PAGE膠對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離后，采用半干法將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%牛奶封閉，37 ℃，室溫。一抗孵育(抗TAZ，Cell Signaling；抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBPβ)，Boster；抗PPARγ，Boster；抗GAPDH，Bioworld)，4 ℃，過(guò)夜。二抗37 ℃孵育1 h。分析蛋白條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組別大鼠股骨內(nèi)脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)、熒光標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)、IRS-1濃度比較 對(duì)大鼠股骨進(jìn)行HE染色，計(jì)數(shù)脂肪細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組間脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),OVX組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)多于對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對(duì)照組和假手術(shù)組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。利用免疫熒光染色對(duì)脂肪細(xì)胞標(biāo)記物圍脂滴蛋白進(jìn)行標(biāo)記并計(jì)數(shù)，分析結(jié)果與HE染色結(jié)果趨勢(shì)一致。ELISA法測(cè)定大鼠股骨內(nèi)IRS-1濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組間IRS-1濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),OVX組IRS-1濃度低于對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對(duì)照組和假手術(shù)組IRS-1濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

表1 不同組別大鼠股骨內(nèi)脂肪細(xì)胞、熒光標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)和IRS-1濃度比較

2.2IRS-1基因高表達(dá)對(duì)油紅O染色結(jié)果和成脂分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后，對(duì)其進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用pCMV-IRS-1轉(zhuǎn)染后，IRS-1組BMSCs的脂滴明顯少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖2A)。進(jìn)一步對(duì)油紅O吸光度進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，3組油紅O吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IRS-1高表達(dá)組吸光度值低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BMSCs成骨誘導(dǎo)3 d后，采用Western blot方法對(duì)成脂分化相關(guān)蛋白TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRS-1組TAZ的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖2B)。進(jìn)一步對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，3組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), IRS-1組TAZ的表達(dá)量高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IRS-1基因高表達(dá)對(duì)油紅O染色和TAZ、CEBPβ、PPARγ表達(dá)影響的定量分析

2.3IRS-1或TAZ基因敲除對(duì)油紅O染色結(jié)果和成脂分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 油紅O染色結(jié)果提示，SiIRS-1組和SiTAZ組脂滴明顯多于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖3A)。進(jìn)一步對(duì)油紅O吸光度進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，4組間油紅O吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SiIRS-1組和SiTAZ組吸光度值高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), SiIRS-1組和SiTAZ組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示，SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖3B)。進(jìn)一步對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，4間組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ的表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SiIRS-1組和SiTAZ組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 IRS-1或TAZ基因敲除對(duì)油紅O染色和TAZ、CEBPβ、PPARγ表達(dá)影響的定量分析

3 討 論

在骨髓微環(huán)境中，干細(xì)胞除了向成骨細(xì)胞分化，還可以向其他類型細(xì)胞分化。在干細(xì)胞定向分化系統(tǒng)中，成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞來(lái)源于共同的祖細(xì)胞，成骨分化和成脂分化之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)系最為密切[9]。若BMSCs向成脂細(xì)胞分化，則成骨分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，它們之間相互競(jìng)爭(zhēng)以保持骨髓中不同細(xì)胞類型的穩(wěn)定增長(zhǎng)[10]。因此，骨質(zhì)疏松癥患者，尤其是在老年人群，常常伴隨骨髓脂肪細(xì)胞蓄積。

IRS-1是激素受體后錨定蛋白，能結(jié)合下游特定靶分子，進(jìn)而參與調(diào)控多種細(xì)胞代謝過(guò)程，脂代謝便是其中之一[11]。本研究采用大鼠BMSCs作為研究對(duì)象，油紅O染色及半定量分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)IRS-1則BMSCs向成脂細(xì)胞分化被抑制，敲低IRS-1則BMSCs向成脂細(xì)胞分化增多。既往研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄共活化因子TAZ可與成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ結(jié)合，減少其下游靶基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制成脂分化進(jìn)程[12-13]。作為YAP類似物，TAZ第89位絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化后，與14-3-3蛋白結(jié)合，將復(fù)合體阻滯于細(xì)胞質(zhì)，使復(fù)合體進(jìn)一步蓄積，從而發(fā)揮相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或信號(hào)組織作用。目前研究表明，TAZ可能受上游多條信號(hào)通路的調(diào)控，包括TGFβ、BMP、Wnt等信號(hào)通路[14]?？梢?jiàn)，胰島素信號(hào)通路的樞紐分子IRS-1也是TAZ的上游信號(hào)，可通過(guò)靶向調(diào)控TAZ表達(dá)影響B(tài)MSCs向成脂細(xì)胞分化的進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IRS-1則成脂分化標(biāo)志物C/EBPβ、PPARγ表達(dá)下調(diào)，敲低IRS-1和TAZ則成脂分化標(biāo)志物C/EBPβ、PPARγ表達(dá)上調(diào)。C/EBPs蛋白家族表達(dá)于多種細(xì)胞類型，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生命過(guò)程[15]。目前已發(fā)現(xiàn)6個(gè)C/EBPs蛋白家族成員：C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和C/EBPζ(又稱為CHOP-10)。其中，C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪細(xì)胞分化早期標(biāo)志物，在成脂分化誘導(dǎo)劑處理后，脂肪細(xì)胞前體中C/EBPβ、C/EBPδ表達(dá)即可達(dá)峰。更重要的是，即使不添加成脂誘導(dǎo)劑，C/EBPβ也可促使脂肪細(xì)胞前體進(jìn)入脂肪細(xì)胞分化程序。另一方面，PPARs是一類配體激活核轉(zhuǎn)錄因子超家族，包括3種亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ[16]。在成脂分化早期，活化的C/EBPβ和C/EBPδ將進(jìn)一步激活C/EBPα和PPARγ。C/EBPα和PPARγ不僅促進(jìn)自身表達(dá)，同時(shí)還能促進(jìn)相互表達(dá)，并且對(duì)大部分脂肪細(xì)胞分化的特異性基因(如aP2、GLUT4等)的表達(dá)是必不可少的[17]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IRS-1引起C/EBPβ、PPARγ表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明成脂分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分阻斷。反之，敲低IRS-1和TAZ引起C/EBPβ、PPARγ表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明成脂分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。可見(jiàn)，IRS-1/TAZ信號(hào)通路可通過(guò)C/EBPβ、PPARγ調(diào)控BMSCs成脂分化進(jìn)程。

綜上所述，IRS-1通過(guò)上調(diào)TAZ表達(dá)，抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化。因此，IRS-1/TAZ信號(hào)可作為控制骨質(zhì)疏松癥骨髓脂肪化的重要靶點(diǎn)。(本文圖見(jiàn)封三)