徐彥楠，孟 麗，朱 艷，閆 靜，王彥玲，周晨明*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050017;3.河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室，河北 石家莊 050017)

胃癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，對(duì)人類的健康造成巨大威脅。其發(fā)病率和病死率分別位于世界惡性腫瘤第4位和第2位[1]。目前，在臨床上主要通過手術(shù)切除病灶來治療癌癥改善病情。但是臨床癥狀對(duì)于胃癌早期患者來說并不明顯，以至于就診率很低。并且目前在診療過程中缺乏診斷胃癌的生物學(xué)指標(biāo)，導(dǎo)致眾多出現(xiàn)臨床癥狀的患者在確診時(shí)已是伴有轉(zhuǎn)移的中晚期胃癌[2]。最佳手術(shù)治療時(shí)期已經(jīng)錯(cuò)過，非手術(shù)治療是唯一緩解病情的方式。目前，放療與化療已被廣泛應(yīng)用于中晚期腫瘤的非手術(shù)治療中，但在治療過程中容易出現(xiàn)不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)器官衰竭。因此，尋找高效低毒的天然藥物至關(guān)重要。青蒿素是1971年我國(guó)科學(xué)家在中草藥青蒿中分離出的環(huán)狀倍半萜類化合物，是一種低毒、高效治療瘧疾的天然藥物。青蒿素難溶于水，使其療效不能充分的發(fā)揮，因此合成了抗瘧效果強(qiáng)于青蒿素且低毒、安全的青蒿素衍生物——雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)。有研究表明，DHA對(duì)宮頸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、淋巴癌和前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯地抑制作用[3-8]，但是否能抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞及其作用機(jī)制的研究尚未報(bào)道。因此，本研究旨在探討DHA抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞增殖并促凋亡的作用及作用機(jī)制，以期為中藥抗腫瘤藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材 料 與 方 法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞；DHA購自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)(methylthiazoletetrazolium,MTT)購自美國(guó)Pharma Minger公司；兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8單克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗兔二抗購自康為世紀(jì)生物試劑公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國(guó)Formascientific公司；酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀購自比利時(shí)Consort公司；超薄切片機(jī)UC7購自德國(guó)徠卡公司；流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司；透射電子顯微鏡H-7500購自日本日立公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中，每周傳代2～3次，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2MTT法檢測(cè)DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BGC-823細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS進(jìn)行清洗，加入0.25%胰酶進(jìn)行消化，用培養(yǎng)基調(diào)成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待貼壁后根據(jù)分組加入不同濃度的DHA[0(對(duì)照組)，0.67，1.34，2.68，5.36，10.72 μmol/L]生長(zhǎng)24，48，72 h。定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，孵育4 h后，棄上清加入150 μL/孔 二甲基亞砜。利用酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)490 nm測(cè)各孔吸光值(absorbance，A)，根據(jù)下列公式計(jì)算DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%，并將上述計(jì)算結(jié)果用82798-IC50軟件計(jì)算出DHA作用的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、1.7 μmol/L組、3.4 μmol/L組、6.8 μmol/L組。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以1×105個(gè)/mL的濃度接種5 mL BGC-823細(xì)胞，24 h后在對(duì)照組加入3 mL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中分別加入3 mL終濃度為1.7、3.4、6.8 μmol/L DHA，之后繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)并收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)0.04%乙二胺四乙酸消化，離心，收集細(xì)胞。用預(yù)冷PBS重懸，離心、清洗兩次，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇吹打制成單細(xì)胞懸液。上機(jī)檢測(cè)前棄乙醇，用PBS清洗重懸，取單細(xì)胞懸液0.1 mL，加入1 mL碘化丙啶染液，將其置于4 ℃冰箱避光繼續(xù)孵育30 min，以500目銅網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè)凋亡率。

1.2.4DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)影響 分組同F(xiàn)CM，每組均做3個(gè)復(fù)孔，給藥方式同F(xiàn)CM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心，棄上清，PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，DAPI避光孵育3 min，PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。收集細(xì)胞，離心成團(tuán)，棄上清，加入2.5%戊二醛進(jìn)行前固定、1%四氧化鋨后固定1.5 h、經(jīng)50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水、Epon812樹脂包埋、超薄切片機(jī)切50 nm超薄切片、醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色各30 min，在透射電子顯微鏡下檢測(cè)、拍照。

1.2.5Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組及處理同F(xiàn)CM，繼續(xù)孵育48 h后，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌，用裂解液裂解60 min，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。之后進(jìn)行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜，再進(jìn)行免疫反應(yīng)：將膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8孵育，4 ℃冰箱過夜；TBST洗滌3次后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，滴加發(fā)光液，顯影并采用凝膠圖像系統(tǒng)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖活性的影響 不同濃度DHA作用于BGC-823細(xì)胞后，其抑制率隨藥物濃度的增加而增大，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，具有顯著的劑量和時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。DHA作用的IC50為3.4 μmol/L。

表1 不同濃度DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率比較

2.2FCM檢測(cè)DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的影響 隨著DHA藥物濃度的增加，凋亡峰愈加明顯，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2，圖1。

2.3DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，對(duì)照組呈現(xiàn)淡藍(lán)色熒光，且分布均勻、形態(tài)完整；隨著DHA濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，藍(lán)色熒光增強(qiáng)，部分細(xì)胞核呈現(xiàn)顆粒團(tuán)狀染色質(zhì)或碎裂成許多球形顆粒物質(zhì)，見圖2。透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征：對(duì)照組細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻；1.7 μmol/L組細(xì)胞輕度固縮，染色質(zhì)電子密度增加，邊集于核膜下；3.4 μmol/L組細(xì)胞固縮加重，核膜下染色質(zhì)邊集進(jìn)一步增厚；6.8 μmol/L組細(xì)胞體積明顯縮小，胞質(zhì)高度濃縮，染色質(zhì)邊集更加明顯，見圖3。

表2 FCM檢測(cè)不同濃度DHA作用48 h后BGC-823細(xì)胞凋亡率比較

2.4DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8的影響 Western blotting結(jié)果表明，BGC-823細(xì)胞隨著DHA用藥濃度的增大，Bax、Caspase-3、Caspase-8條帶變寬、變深。細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)隨著DHA給藥濃度的增加而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖4。

表3 不同濃度DHA及對(duì)照組作用48 h后BGC-823細(xì)胞Bax 、Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)

Figure 3 BGC-823 cells morphology using transmission electron microscope

3 討 論

我國(guó)每年新增的胃癌患者約為67.9萬，死亡約為49.8萬，占全球總?cè)藬?shù)的45%[9]。雖然近些年，通過改善飲食習(xí)慣、降低危險(xiǎn)因素等方法，胃癌發(fā)病率逐年降低，但仍是常見的惡性腫瘤之一。抑制腫瘤生長(zhǎng)是目前臨床治療腫瘤的重要途徑。DHA是青蒿素的主要衍生物，對(duì)多種組織的人類惡性腫瘤具有明顯的細(xì)胞毒性作用[3-8]。為了考察DHA抗胃癌的作用和機(jī)制，本研究采用人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞探討DHA抗胃癌的效果及機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過MTT檢測(cè)DHA對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用明顯且具有時(shí)間和劑量依賴性。

在MTT檢測(cè)過程中，通過倒置顯微鏡可見用藥組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，主要負(fù)責(zé)清除那些已經(jīng)高度損壞、被破壞、老化和不可修復(fù)的細(xì)胞，以維持多細(xì)胞生物的正常生理過程。細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異?？梢詫?dǎo)致和促進(jìn)多種疾病如：自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心臟病和癌癥等的發(fā)生[10-12]。因此，涉及細(xì)胞凋亡調(diào)控的因素對(duì)疾病的診斷和干預(yù)有著巨大的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過 FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著DHA給藥濃度的升高，細(xì)胞凋亡率也隨之升高，表現(xiàn)為明顯濃度依賴性。進(jìn)一步通過熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)用藥組細(xì)胞隨著給藥濃度的升高，細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化更加明顯，與FCM結(jié)果一致。

Caspases是屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的一類蛋白質(zhì)，在凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用[13]。內(nèi)源性和外源性凋亡都依賴于Caspases家族成員的激活。在細(xì)胞凋亡之前，細(xì)胞的表面受體會(huì)傳遞一種來自細(xì)胞外微環(huán)境的死亡信號(hào)，“死亡”配體與其受體結(jié)合，形成誘導(dǎo)死亡的信號(hào)復(fù)合體，然后激活Caspase-8，進(jìn)一步激活Caspase-3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。Caspase-8主要位于線粒體，少數(shù)位于胞質(zhì)和胞核中，其介導(dǎo)TNFR1等死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是凋亡途徑關(guān)鍵的啟動(dòng)者[15]。Caspase-3是整個(gè)凋亡通路的中樞，是Caspase凋亡級(jí)聯(lián)通路的效應(yīng)體，Caspase-3在啟動(dòng)外部凋亡通路和內(nèi)部凋亡通路后均被激活，其作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，通過特異性地裂解底物最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。Bax 又稱成孔蛋白，是Bcl-2家族中經(jīng)典的促凋亡因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[17]。它可以在線粒體外膜上形成孔，導(dǎo)致線粒體的破壞并使細(xì)胞色素C釋放增加，與Apaf-1相互作用，導(dǎo)致Caspase-9的激活，引起Caspases 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。有研究表明，Bax、Caspase-3、Caspases-8基因的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting測(cè)定Bax、Caspase-3、Caspase-8基因表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)量用藥組高于對(duì)照組，提示DHA可以使Bax、Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

由此可見，DHA對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax、Caspase-3、Caspases-8的表達(dá)而起作用，但DHA誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。