于 萍，王曉娥，崔 宇，陳 元

（中山大學(xué)1.中山醫(yī)學(xué)院；2.附屬第一醫(yī)院麻醉科；3.醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510080）

瑞芬太尼是一種超強效的μ阿片受體（μ opi?oid receptor，MOR）激動劑，具有作用時間短、起效快、消除作用迅速等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于手術(shù)麻醉［1］。然而，大量研究發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼的長時間或大劑量輸注可引起痛覺過敏（remifentanil-induced hyperalgesia，RIH），表現(xiàn)為痛閾降低、痛感增強或痛覺異常［2］。以往研究表明，RIH 涉及的分子機制可能有MOR 表達水平下調(diào)和功能改變、NMDA受體的激活、脊髓膠質(zhì)細胞的活化等多方面［3］，但RIH 的具體機制尚未明確。其中，MOR 水平下調(diào)和功能改變是RIH 形成的重要原因［4］。蛋白激酶C（PKC）屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸酶，包含十余種亞型，盡管研究發(fā)現(xiàn)，阿片類藥物誘導(dǎo)的MOR改變依賴于PKC，但具體亞型尚未明確［5］。PKCε在脊髓組織中表達豐富，參與多種疼痛調(diào)節(jié)［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后脊髓PKCε表達顯著增加，抑制PKCε可以有效延緩?fù)从X過敏的發(fā)生，提示脊髓PKCε在慢性疼痛中具有重要作用［6-7］。然而，PKCε是否參與RIH 以及PKCε是否介導(dǎo)瑞芬太尼誘導(dǎo)的MOR 改變目前未見報道。本研究擬通過觀察RIH 大鼠脊髓組織中PKCε和MOR 的表達水平，并通過預(yù)先鞘內(nèi)注射不同的PKC 抑制劑觀察大鼠行為學(xué)變化以及檢測脊髓MOR 蛋白表達變化，初步探究RIH 大鼠模型中PKCε與MOR 之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究的實驗動物均由中山大學(xué)實驗動物中心提供提供，所有實驗操作均符合中山大學(xué)動物實驗中心倫理委員會要求并按照實驗動物使用原則執(zhí)行。18 只體質(zhì)量為220～250 g 的SPF 級成年雄性SD 實驗大鼠隨機均分成3 組，即空白對照組（C 組）、生理鹽水組（S 組）、瑞芬太尼組（R 組）。C 組：大鼠正常飼養(yǎng)；R 組：輸注瑞芬太尼4 μg/（kg·min）給藥2 h，丙泊酚12 mg/（kg·h）給藥2 h；S 組：實驗大鼠經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注R 組同等劑量生理鹽水和丙泊酚12 mg/（kg·h）給藥2 h。第二批實驗增加R+BIS 組和R+G?6983組；R+BIS組：瑞芬太尼痛敏模型建立前30 min 鞘內(nèi)注射BIS，之后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/（kg·min）給藥2 h、丙泊酚12 mg/（kg·h）給藥2 h；R+G?6983組：瑞芬太尼痛敏模型建立前30 min 鞘內(nèi)注射G?6983，之后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/（kg·min）給藥2 h、丙泊酚12 mg/（kg·h）給藥2 h［8］。SD 實驗大鼠置于安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件包括：房間采用12 h 明-暗交替且保持恒溫（22±0.5）℃、恒濕（55±10）%、保證SD 實驗大鼠自由飲食。

1.2 實驗方法

1.2.1 瑞芬太尼痛敏模型建立 生理鹽水稀釋瑞芬太尼（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，中國）至終濃度40 μg/mL 備用，生理鹽水稀釋丙泊酚（廣東嘉博制藥有限公司，中國）至終濃度250 μg/mL 備用。SD 實驗大鼠吸入七氟烷（上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，中國）麻醉側(cè)臥后，尾靜脈置入靜脈留置針，連接恒速電子注射泵，S 組輸注生理鹽水和丙泊酚2 h。R 組持續(xù)輸注瑞芬太尼和丙泊酚2 h。大鼠術(shù)中保持自主呼吸。

1.2.2 鞘內(nèi)注射生理鹽水稀釋 BIS（Sigma，美國）和G?6983（Sigma，美國）至終濃度分別為10 μmol/L和1 μmol/L 備用。采用Mestre 法［9］進行大鼠鞘內(nèi)注射。RIH大鼠模型建立前30 min，SD實驗大鼠吸入七氟烷麻醉俯臥后，備皮消毒SD 大鼠脊柱，以50 μL 微量注射器于SD 實驗大鼠脊柱L4-15 椎間隙垂直進針，以大鼠尾巴出現(xiàn)抖動為成功進入髓鞘內(nèi)信號，此時緩慢注入抑制劑BIS或G?6983 10 μL。

1.2.3 行為學(xué)測試 測試前3 d，將SD 實驗大鼠放于行為學(xué)測試室每天分籠適應(yīng)2 h，適應(yīng)行為學(xué)測試環(huán)境。尾靜脈輸注藥物前24 h 測試SD 實驗大鼠基礎(chǔ)痛閾值，將輸注結(jié)束后第6 h、24 h 設(shè)為行為學(xué)測試時間點。SD 實驗大鼠在測試前1 h 于行為學(xué)測試室適應(yīng)環(huán)境，采用Hargreaves［10］熱痛測試法（thermal paw withdrawal latency，PWTL，以s 為單位）進行行為學(xué)測試。設(shè)置熱輻射刺激儀（SERIES 8 Model 390G IITC，Life Science，美國）參數(shù)包括：基礎(chǔ)光強：5 V；光強：30 V；自動斷電時間：20 s。SD 實驗大鼠處于安靜狀態(tài)時用熱輻射源照射SD 實驗大鼠右后足底正中處，記錄從開始給予熱刺激到大鼠出現(xiàn)反射性撤足的時間，每只大鼠重復(fù)測量3 次，每次間隔5 min，取3 次平均值為該SD 實驗大鼠的熱痛閾值。

1.2.4 免疫熒光染色 SD實驗大鼠腹腔注射10%水合氯醛（上海生工，中國）進行深度麻醉。麻醉后暴露大鼠胸腔，剪開心尖后，針頭經(jīng)左心室至升主動脈并固定，剪右心耳，快速灌注預(yù)冷的生理鹽水500 mL 后改灌注500 mL 預(yù)冷的40 g/L 多聚甲醛40 min 進行固定。灌注結(jié)束后，解剖取出SD 實驗大鼠脊髓腰椎膨大處，置于預(yù)冷的40 g/L 多聚甲醛中后固定4 h，隨后轉(zhuǎn)入30% 蔗糖溶液中4℃過夜。待脊髓組織沉底后用OCT 包埋進行冰凍切片，片厚20 μm，直接貼片于載玻片上。

組織冰凍切片用1×PBS清洗3次，每次10 min。室溫下封閉液封閉1 h。棄去封閉液后分別加入一抗（PKCε，1∶100，BD 美國；MOR，1∶200，abcam英國；OX-42，1∶200，Cell Signaling TECHNOLOGY美國；millipore 美國；GFAP，1∶200，NeuN，1∶200，abcam 英國），4 ℃濕盒孵育過夜。之后，1×PBS 洗3 次，10 min/次，洗去一抗后，置于相應(yīng)的二抗（1∶1 000）中，室溫避光孵育1 h，1×PBS 清洗3 次，10 min/次。洗去二抗。晾干后于正置熒光顯微鏡（Olympus BX63，日本）下觀察并拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR 應(yīng)用TIANGEN 試劑盒（TIANGEN，中國）提取SD 實驗大鼠脊髓組織總RNA，采用兩步法將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green 法（TAKARA，日本）進行實時熒光定量PCR 反應(yīng)。設(shè)定GAPDH 為內(nèi)參：上游引物：TGCCACTCAGAAGACTGTGG；下游引物：TTCAG?CTCTGGGATGACCTT。PKCε上游引物：AACGAG?TGTTTAGGGAGCGG；下游引物：GTTTCTTTAGC?CCAGCGCAC。MOR 上游引物：CAACTTGTCCCA?CGTTGATG；下游引物：TCCAAAGAGGCCCACTA?CAC。擴增條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。實驗重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值，計算并統(tǒng)計分析結(jié)果。

1.2.6 蛋白免疫印跡 取SD實驗大鼠脊髓組織稱重后加入蛋白裂解液，采用KZ-11高速組織研磨儀（Servicebio，中國）研磨，60 Hz，60 s。4 ℃14 000 r/min離心25 min（離心機半徑r=5 cm），取上清液。采用BCA 法測定蛋白樣品濃度，剩余蛋白加入上樣緩沖液于95℃煮樣10 min。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離靶蛋白并以恒流250 mA電轉(zhuǎn)90 min至PVDF 膜上。電轉(zhuǎn)后，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉PVDF膜1 h。之后，4 ℃下水平搖床孵育一抗（PKCε，1∶1 000，BD 美國；MOR，1∶2 000，abcam 英國）過夜。次日，1×TBST 緩沖液清洗PVDF膜3次，10 min/次。室溫下孵育二抗（1∶10 000）1 h，之后1×TBST 緩沖液洗PVDF 膜3 次，10 min/次，曝光。結(jié)果使用Image J 軟件進行灰度分析，以Relative Density（以下簡稱RD）表示各組測定灰度值與C 組比值，進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。行為學(xué)結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR 結(jié)果采用單因素方差分析比較。以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尾靜脈輸注瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠熱痛閾值降低

本實驗通過構(gòu)建RIH 大鼠模型檢測瑞芬太尼輸注后大鼠熱痛行為學(xué)變化，采用重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示：各組大鼠熱痛閾值滿足球形分布（χ2=4.12，P=0.86；χ2=11.32，P=0.26），各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.60，P< 0.001；F=54.07，P< 0.001），各組時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.84，P<0.001；F=15.34，P<0.001），且組間和時間點有交互效應(yīng)（F=13.53，P< 0.001；F=12.47，P<0.001）。大鼠尾靜脈注射生理鹽水后與C組相比各時間點PWTL差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.78，P> 0.05），而靜脈注射瑞芬太尼6 h后，PWTL與C組比較明顯降低［PWTL=（8.95±1.16）s，F(xiàn)=27.43，P<0.001］。在給藥后24 h大鼠的熱痛覺閾值顯著下降［PWTL=（5.31±0.87）s，F(xiàn)=69.81，P<0.001］，見圖1。

圖1 靜脈輸注瑞芬太尼降低大鼠熱痛閾值Fig.1 Intravenous infusion of remifentanil reduces PWTL in rats

2.2 瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的PKCε表達增加、MOR 表達減少

對PKCε蛋白印跡相對灰度值進行單因素方差分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=118.736，P< 0.001）：與C 組進行比較，PKCε在瑞芬太尼輸注后的6 h 蛋白表達水平增加（RD=1.79±0.08，P<0.001），且在瑞芬太尼輸注后的24 h 蛋白表達水平顯著增加（RD=3.01±0.24，P<0.001）；我們對MOR蛋白印跡相對灰度值進行單因素方差分析結(jié)果顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=144.303，P<0.001）：與C 組進行比較，MOR 在輸注后的6 h 蛋白表達水平減少（RD=0.68±0.04，P<0.001），在輸注后的24 h 蛋白表達水平顯著減少（RD=0.43±0.02，P<0.001），見圖2。

采用熒光定量PCR 方法檢測瑞芬太尼輸注后大鼠脊髓組織中PKCε、MOR 的mRNA 的表達變化情況。與蛋白印跡結(jié)果一致的是PKCε的mRNA 表達水平的單因素方差分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.873，P< 0.001）；與C 組相比較，PKCε的mRNA 在尾靜脈輸注瑞芬太尼后24 h 表達顯著增加（P< 0.001）；我們對MOR 蛋白印跡相對灰度值進行單因素方差分析結(jié)果顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.883，P<0.001）；與C組相比較，MOR 的mRNA 在輸注后24 h 表達顯著降低（P<0.001），見圖3。

圖2 輸注瑞芬太尼影響大鼠脊髓組織中PKCε、MOR 的蛋白水平表達變化Fig.2 Remifentanil infusion affects the expression of PKCε and MOR protein levels in the spinal cord

圖3 輸注瑞芬太尼影響大鼠脊髓組織中PKCε、MOR 的mRNA 水平表達變化Fig.3 Remifentanil infusion affects the expression of PKCε and MOR mRNA levels in the spinal cord

為了觀察和PKCε和MOR 分布情況，我們利用免疫熒光化學(xué)染色方法將R24h 組的PKCε、MOR 分別與星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記蛋白GFAP、小膠質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白OX-42 和神經(jīng)元標(biāo)志蛋白NeuN共染。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，PKCε和MOR 分別主要在脊髓背角神經(jīng)元分布（圖4、5）。以上結(jié)果表明，瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的PKCε蛋白表達增加、MOR 蛋白表達減少，提示PKCε和MOR 參與RIH。

圖4 PKCε與星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元雙染結(jié)果Fig.4 Co-localization of PKCε and astrocyte，microglia or neuron in the spinal dorsal cord

2.3 預(yù)先鞘內(nèi)注射不同的PKC 抑制劑對瑞芬太尼誘導(dǎo)的大鼠痛覺過敏的影響

為進一步探究PKCε在瑞芬太尼引起的大鼠痛覺過敏中的作用，我們選用了兩種不同的PKC相對抑制劑BIS 和G?6983。與R 組［PWTL=（11.93 ±0.07）s］相比較，建立瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛敏模型前30 min 鞘內(nèi)注射BIS 后大鼠熱痛過敏顯著緩解，分別在輸注瑞芬太尼后6 h［PWTL=（12.52 ±0.07）s，P< 0.001］、24 h［PWTL=（11.93 ± 0.90）s，P< 0.001］的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而預(yù)先鞘內(nèi)注射G?6983 與C 組相比較不能緩解大鼠熱痛過敏（P>0.05），見圖6。

2.4 預(yù)先鞘內(nèi)注射不同的PKC 抑制劑對MOR 蛋白表達影響

輸注瑞芬太尼后24 h，分別對C 組、R 組、R+BIS 組和R+G?6983 組大鼠脊髓MOR 蛋白進行單因素方差分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=517.816，P<0.001）。相較于C 組，R+G?6983組MOR 蛋白表達水平降低（RD=0.52 ± 0.01，P<0.001），與R 組（RD=0.49 ± 0.01，P< 0.001）趨勢一致。而相較于R 組，由瑞芬太尼引起的MOR蛋白降低現(xiàn)象可以被BIS（RD=1.09 ± 0.04，P<0.001）所改變（圖7）。以上實驗結(jié)果提示PKCε可能介導(dǎo)瑞芬太尼誘導(dǎo)痛敏模型中MOR 下調(diào)。

圖5 MOR 與星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元雙染結(jié)果Fig.5 Co-localization of MOR and astrocyte，microglia or neuron in the spinal cord

圖6 不同的PKC 抑制劑預(yù)處理影響瑞芬太尼誘導(dǎo)的大鼠熱痛閾值Fig.6 Effects of pretreatment with different PKC inhibitors on PWTL induced by remifentanil in rats

3 討論

本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)了脊髓PKCε在RIH大鼠中的蛋白、mRNA表達增加，并且預(yù)先鞘內(nèi)注射BIS 可以有效緩解大鼠痛覺過敏，而使用G?6983則無明顯變化，BIS 是PKC 的廣譜抑制劑，抑制包括PKCε在內(nèi)的多種PKC 亞型，而G?6983 僅抑制PKCα、PKCδ等亞型，不抑制PKCε［11］。提示PKCε參與了RIH。同時，我們發(fā)現(xiàn)RIH 大鼠脊髓MOR蛋白、核酸表達水平降低，且PKCε和MOR 均與脊髓背角神經(jīng)元共定位，我們進一步研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射BIS 可抑制瑞芬太尼引起的脊髓MOR 蛋白表達水平降低，提示PKCε可能通過下調(diào)MOR 介導(dǎo)RIH 的病理生理過程。

圖7 不同的PKC 抑制劑預(yù)處理抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的大鼠脊髓中MOR 的蛋白表達降低Fig.7 Pretreatment of different PKC inhibitors block the decreased expression of MOR protein levels induced by remifentanil in rats

瑞芬太尼作為一種人工合成的超強效的μ阿片受體激動劑比其他阿片類藥物更容易誘導(dǎo)痛覺過敏，且RIH大鼠模型現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于研究阿片類藥物誘導(dǎo)痛覺過敏（opioid-induced hyperalgesia，OIH）的作用機制。本實驗采用的4 μg/（kg·min）輸注劑量已被證實可用于成功構(gòu)建瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺過敏模型［12］，與Zhao 等［13］研究一致。MOR 被認為是臨床上阿片類鎮(zhèn)痛藥物的主要作用靶點［14］。研究表明長時間輸注MOR 激動劑可以促進急性疼痛向慢性疼痛的轉(zhuǎn)化［15］。研究發(fā)現(xiàn)輸注瑞芬太尼可誘導(dǎo)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)MOR表達下調(diào)，與我們發(fā)現(xiàn)RIH 大鼠脊髓MOR 蛋白、核酸表達水平下調(diào)結(jié)果相似［16］。

據(jù)報道［5-6］，激活的PKCε從細胞質(zhì)中移位到細胞膜上磷酸化相應(yīng)的下游底物，增強外周神經(jīng)細胞的興奮性，參與突觸信息傳遞，在傷害感受器致敏和機械痛覺過敏中發(fā)揮重要作用。Chu 等［7］通過使用si RNA 干擾明確了PKCε介導(dǎo)嗎啡誘導(dǎo)的MOR表達下調(diào)改變且該實驗通過誘導(dǎo)基因突變證實了在MOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中，Gαi2 的Ser44、Ser144 和Ser302 被嗎啡激活的PKCε磷酸化從而引起MOR 表達下調(diào)，進而導(dǎo)致嗎啡耐受。然而瑞芬太尼引起的痛覺過敏中MOR 表達水平改變的具體機制并不明確，我們的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓MOR在預(yù)先鞘內(nèi)注射BIS 的RIH 大鼠中的蛋白表達水平降低現(xiàn)象被抑制，說明PKCε可能參與調(diào)控RIH中MOR 的表達。

PKCε轉(zhuǎn)位對于其發(fā)揮磷酸化具有重要意義，然而，瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏模型中PKCε轉(zhuǎn)位與MOR 的改變的關(guān)系尚不清楚。我們推測：瑞芬太尼輸注后激活PKCε發(fā)生轉(zhuǎn)位，活化的PKCε可能通過直接磷酸化MOR 或其他受體導(dǎo)致MOR 內(nèi)化，MOR 內(nèi)化后其中部分受體有可能在細胞質(zhì)內(nèi)被酶水解而使回到細胞膜上的MOR 減少導(dǎo)致MOR 脫敏，進而產(chǎn)生痛覺過敏。因此，PKCε在瑞芬太尼引起的痛敏模型中的磷酸化作用以及作用靶點有待相關(guān)研究中進一步探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明脊髓背角神經(jīng)元PKCε和MOR 參與瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺過敏，同時PKCε可能調(diào)控MOR 表達水平變化。該結(jié)果為研究瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的發(fā)生機制提供了新的理論依據(jù)，也為進一步研究瑞芬太尼痛覺過敏的防治提供了理論基礎(chǔ)。