溫藝紅 ，楊真禎，張 銘，朱杰寧，楊 瑩，符永恒，方咸宏，單志新，，，4

（1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣東省臨床藥理學(xué)重點實驗室，廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080；4.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510280）

當(dāng)心肌發(fā)生纖維化時，心肌組織會出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，引起心肌僵硬度增加、舒張和收縮力減弱以及心律失常等問題，導(dǎo)致心力衰竭和心源性猝死。已有研究表明，促纖溶和促炎癥信號通路的激活可以引發(fā)或加劇心肌纖維化［1-2］。目前，心肌纖維化的具體分子機(jī)制尚未闡明，臨床上缺乏有效的心肌纖維化診療手段。早在1970 年，環(huán)形RNA（circular RNA，circRNA）就被發(fā)現(xiàn)，但是當(dāng)時被認(rèn)為是一些錯誤剪接，不具備功能的RNA，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，circRNA 的多種功能才不斷被認(rèn)識［3］。CircRNA 不具備5′末端帽子和3′多聚polyA 尾，并以共價鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子，在個體不同的發(fā)育階段和組織中體現(xiàn)出表達(dá)特異性［4］。環(huán)狀的circRNA 相比于線形RNA，具有明顯的RNA穩(wěn)定性，可以有效地抵抗RNA 酶的消化作用［5］。CircRNA 可通過多種方式行使生物學(xué)功能，比如“海綿吸附”微小RNA（microRNA，miRNA）或者蛋白，調(diào)節(jié)宿主基因轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽等［6-8］。由于circRNA 由宿主基因的mRNA 前體剪切產(chǎn)生，因此circRNA 在產(chǎn)生的過程中，可能競爭性地抑制宿主基因mRNA 的產(chǎn)生，從而起到影響宿主基因表達(dá)的作用［9］。研究證實，circRNA 參與心肌損傷與修復(fù)、動脈粥樣硬化、心肌缺血梗死、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等過程［10-11］。如有研究發(fā)現(xiàn)circFndc3b在心肌梗死后表達(dá)顯著下調(diào)，它通過與融合肉瘤（fused in sarcoma，F(xiàn)US）RNA 結(jié)合蛋白相互作用來增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的表達(dá)和信號傳導(dǎo)，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)新生血管形成，起到心肌保護(hù)作用［12］。我們的工作證實，circRNA_000203 在纖維化的小鼠心肌中表達(dá)明顯上調(diào)，它可以通過特異結(jié)合miR-26b-5p 來促進(jìn)Col1a2 和Ctgf 基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)心肌纖維化作用［13］。利用臨床的長期持續(xù)性房顫（AF）病人和竇性心律（SR）病人左心耳組織進(jìn)行circRNAs 表達(dá)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)來源于宿主基因KLHL20（Kelch-like protein 20，KLHL20）的ciRNA_100395 表達(dá)顯著降低。目前對于circRNA_100395 調(diào)控心肌纖維化的作用尚不清楚。本文研究circRNA_100395 對人心房肌成纖維細(xì)胞（human atrial myofibroblasts，HAFs）中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用機(jī)制，可為以circRNA 為靶點的心肌纖維化治療研究提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

AF 患者（持續(xù)出現(xiàn)房顫的時間不低于1 年），男性，年齡介于45～65 歲，左心耳切除術(shù)后廢棄的新鮮心耳組織。竇性心律（SR）病人的左心耳由無心臟疾病的器官捐獻(xiàn)者提供，性別、年齡與AF患者配對。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號No.GDREC2019238H（R1）），手術(shù)標(biāo)本來源：廣東省心血管病研究所。

1.2 主要試劑

從Gibco 購買的有DMEM/F-12（1：1）basic，特級澳洲胎牛（Fetal Bovine Serum，Qualified）及0.25% EDTA-胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）購自Sigma；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、PacⅠ和PmeⅠ購自NEB 公司；Masson三色染色試劑盒購自中國北京索萊寶科技有限公司；空載體pAd-Track-cmv、BJ5183 E.coli菌株和pAd-Easy-Ⅰ質(zhì)粒購自Coloncancer；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Fermentas），去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Omega）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 及Oligo 和TRIzol 試劑均購于Invitrogen；2×pro Taq HS PCR 預(yù)混液，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 購自湖南艾科瑞公司；4×SDS loading buffer 購自TaKaRa；miR-144-3p mimic和對照組mimic NC 購自廣州銳博公司；鼠抗GAP?DH 抗體、兔抗COL1A1 抗體、兔抗COL3A1 抗體（Protein Technology）；兔抗ACTA2 抗體（Abcam）；TBS 緩沖液粉劑和PBS 緩沖液粉劑（BOSTER）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（碧云天）；蛋白上樣Marker（Fermentas）；Western-blot 顯影ECL 發(fā)光液（Millipore）；PVDF 膜（Whatman）；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega）；RIP 試劑盒（廣州伯信）；鏈霉親和素磁珠（NEB）；其他涉及的生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。本課題所用引物由Invitrogen 公司合成，具體序列見表1。

1.3 主要方法

1.3.1 CircRNAs 表達(dá)譜芯片分析 取AF 和SR 病人的左心耳進(jìn)行circRNAs 表達(dá)譜分析，由上?？党晒緟f(xié)助完成芯片的雜交和結(jié)果分析。主要實驗步驟：用RNAse R 消化人心耳組織RNA 從而獲得總RNA，去除線性RNA 后純化的circRNAs 用隨機(jī)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增后與circRNAs 表達(dá)譜芯片（Arraystar human circRNA Array）上的寡核苷酸cRNA 探針（Arraystar Super RNA labeling kit）進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交后經(jīng)Agilent Scanner G2505 掃描并提取數(shù)據(jù)，最后由Feature Extraction Software 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction

1.3.2 Masson 三色染色 將從手術(shù)室中取得的左心耳組織置于裝有30 mL冰生理鹽水的50 mL離心管中，用剪刀剪取適當(dāng)大小的心耳組織，行40 g/L多聚甲醛固定，然后通過逐步脫水、透明、浸蠟和包埋，再行4 μm 厚度的連續(xù)石蠟切片，選取連續(xù)切片進(jìn)行Masson 三色染色。在顯微鏡下觀察心耳組織中膠原纖維沉積情況，選擇8 個具有代表性的單獨視野（×400）拍照，用于計算統(tǒng)計心肌膠原纖維所占比例（CVF），計算公式為CVF=膠原區(qū)域/總面積。

1.3.3 人心房肌成纖維細(xì)胞（HAF）的原代分離培養(yǎng) 將從手術(shù)室中取得的左心耳用冷PBS 清洗干凈，用滅菌的剪刀和鑷子清除脂肪及筋膜后將心耳組織剪碎，用移液管尖端將組織均勻涂布在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，擰上蓋子，倒扣在培養(yǎng)箱中90 min，加入完全培養(yǎng)基（50 mL 完全培養(yǎng)基中含5 mL 胎牛血清、45 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基，青霉素濃度為1 × 105U/L，鏈霉素則為1 000 mg/L），置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7～10 d 后HAFs從組織中爬出，約30 d細(xì)胞融合度可達(dá)90%，可進(jìn)行傳代。本實驗使用的HAFs 為第3～5 代。

1.3.4 重組circRNA_100395 腺病毒的制備方法circRNA_100395 的序列來自其宿主基因KLHL20的外顯子6～9 序列。按我們報道的方法［14］，在pAd-Track-cmv 載體中的多克隆位點中定向插入circRNA_100395 的模板DNA 后，在BJ5183 大腸桿菌與腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-Easy-I 通過重組。重組成功后，circRNA_100395 腺病毒質(zhì)粒被PacⅠ內(nèi)切酶線性化，并轉(zhuǎn)染到融合度為75%的HEK293T細(xì)胞中包裝circRNA-100395 的重組腺病毒。實驗時以rAd-GFP 作為對照組腺病毒（circRNA-100395 和rAd-GFP 的MOI 均是5）。

1.3.5 熒光實時定量PCR（RT-qPCR）檢測方法從心耳組織或HAFs 中提取總RNA（TRIzol 法），以1.0 μg 總RNA 為模板，用Oligo（dT）15和random primers逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用于檢測circRNA_100395及纖維化相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)。以Gapdh 作為檢測circRNA_100395及纖維化相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)參對照基因。在BIO-RAD CFXconnect（美國，realtime system）進(jìn)行PCR 反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析。以2-ΔΔCT法計算circRNA_100395 及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平。

1.3.6 蛋白印跡法（Western blot） 用PBS 清洗HAFs 并加入預(yù)冷的RIPA 蛋白裂解液，冰上輕柔刮取1 min 后收集細(xì)胞裂解液，在4 ℃，10 000 ×g轉(zhuǎn)速離心15 min，小心取上清液進(jìn)行BCA 法蛋白定量和分裝。加入4× SDS loading buffer，在90 ℃加熱10 min 進(jìn)行蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后以200 mA 恒定電流轉(zhuǎn)印PVDF 膜。用5 %脫脂奶粉（2.5 g 脫脂奶粉溶于50 mL TBST中）4 ℃封閉2 h，分別用相應(yīng)的抗體anti-COL1A1（1∶1 500）、anti-COL3A1（1∶3 000）、anti-α-SMA（1∶3 000）4 ℃搖床孵育過夜。取出PVDF膜用預(yù)冷TBST洗3次，搖床速度為100 r/min，每次約15 min，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗2 次，每次10 min。ECL 發(fā)光試劑盒顯影（A 液∶B 液=1∶1），GAPDH（1∶5 000）作為內(nèi)參對照，用Imagine J 進(jìn)行相應(yīng)檢測蛋白條帶的灰度分析。

1.3.7 雙螢光素酶報告實驗驗證circRNA_1000395與miR-144-3p的結(jié)合作用 按已報道的方法［15］，根據(jù)預(yù)測的circRNA_100395 上潛在的miR-144-3p結(jié)合位點，構(gòu)建包含該潛在結(jié)合序列的雙螢光素酶報告質(zhì)粒pGL3-circRNA_100395，并制備突變該潛在結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-circRNA_100395-MUT。將1 μg重組熒光素酶報告質(zhì)粒、1.5 ng pRLTK（可以表達(dá)海腎熒光素酶，作為內(nèi)參照質(zhì)粒）、100 nmol/L miR-144b-3p mimic 等轉(zhuǎn)染至融合度為70%的HEK293細(xì)胞中，24～30 h后，測定螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，F(xiàn)L）和海腎熒光素酶（Ranilla luciferase，RL）強(qiáng)度，根據(jù)FL/RL 比值來判斷circRNA_100395 與miR-144-3p 間的結(jié)合作用。

1.3.8 RNA pull-down實驗 參照已報道的方法［16］，先用Trizol 法提取100 μg 過表達(dá)circRNA_100395的HAFs 總RNA。將500 μg 鏈霉親和素磁珠清洗重懸后與200 pmol生物素特異性標(biāo)記的miR-144-3p mimic 于室溫下靜置5 min，2 min 手動輕柔上下顛倒混勻，使之充分相互結(jié)合。再加入提取的HAFs 總RNA 中，室溫輕柔混合并孵育30 min 后，加入洗脫緩沖液wash/Binding buffer，置于磁場中收集拉下的RNA 復(fù)合物，RT-qPCR 對circRNA_100395 表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本課題計量資料均采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和做圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；采用單因素方差分析（即one way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，且行Bonferroni 校正的t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)形RNA CircRNA_100395 在AF 病人心耳組織中表達(dá)降低

Masson 染色顯示，與SR 對照組相比，AF 病人的左心耳組織的纖維化程度顯著增加（P< 0.01；圖1A）。CircRNAs 表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，與SR 組相比，AF 組中分別有98 和110 個呈2 倍以上的升高或者降低表達(dá)的circRNAs（圖1B）。CircRNA_100395 由其宿主基因KLHL20 的外顯子6～9 通過反向剪接的方式生成（圖1C）。RT-qPCR結(jié)果顯示，與SR 組相比，AF 組心耳組織中circRNA_100395及其宿主基因KLHL20 表達(dá)顯著降低（P< 0.05，P< 0.01；圖1D）。CircRNA_100395 PCR 產(chǎn)物的DNA 測序結(jié)果顯示，circRNA_100395 特征性的接頭序列正確，進(jìn)一步證實circRNA_100395 在人心耳組織中的表達(dá)（圖1E）。

2.2 CircRNA_100395 在AngⅡ處理的HAFs 中的表達(dá)

在同步化處理后的HAFs 中加入20 μmol/L 的AngⅡ處理24 h，Western-blot 顯示經(jīng)AngⅡ處理的HAFs 中，COL1A1、COL3A1 和α-SMA 表達(dá)顯著增加（P<0.01，圖2A）。RT-qPCR結(jié)果顯示circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20 表達(dá)亦明顯上調(diào)（P<0.05，P<0.01；圖2B）。核質(zhì)RNA的RT-qPCR檢測顯示，circRNA_100395 主要分布于HAFs 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見圖2C。放線菌素D能抑制HAFs胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄，通過放線菌素D處理24 h后，相對比于線形的KLHL20 mRNA，circRNA_100395 具有更好的RNA 穩(wěn)定性（圖2D）。

2.3 CircRNA_100395 能抑制HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)

圖1 CircRNA_100395 在AF 病人心耳中表達(dá)降低Fig.1 Down-regulation of circRNA_100395 in auricles of patients with long-term persistent atrial fibrillation

圖2 CircRNA_100395 在AngⅡ誘導(dǎo)的纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)及核質(zhì)分布Fig.2 Expression and cellular distribution of circRNA_100395 in AngⅡ-induced HAF

利用重組circRNA_100395 腺病毒（rAd-cir?cRNA_100395）感染HAFs 24 h 后，共表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP）顯示HAFs 被充分感染，RT-qPCR結(jié)果證實circRNA_100395 在HAFs 中顯著過表達(dá)（P< 0.001），但KLHL20 表達(dá)不受影響（圖3A）。RT-qPCR 和Western-blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)cir?cRNA_100395 可以抑制Col1a1、Col3a1 和Acta2 表達(dá)，因此，circRNA_100395 具有降低HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用（圖3B、C）。

2.4 CircRNA_100395 通過結(jié)合miR-144-3p 抑制HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)

生物信息學(xué)預(yù)測提示，在circRNA_100395 的第550～569 堿基對之間，可能是與miR-144-3p結(jié)合的序列（圖4A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示，circRNA_100395 與miR-144-3p 有結(jié)合作用，突變預(yù)測的結(jié)合序列后，兩者間的結(jié)合作用消失（圖4B）。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNA_100395 的HAFs 中miR-144b-3p 表達(dá)降低（圖4C）。RNA pull-down 實驗結(jié)果顯示突變miR-144-3p 的種子序列后，miR-144-3p 與cir?cRNA_100395 間的結(jié)合作用明顯降低（P< 0.05；圖4D）。Western-blot 檢測顯示circRNA_100395能抑制HAFs 中COL1A1、COL3A1 和α-SMA 的表達(dá)，而miR-144-3p 增加HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)，并減弱circRNA_100395 抑制纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用（圖4E）。

圖3 過表達(dá)circNRA_100395 可抑制HAF 中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)Fig.3 Over-expression of circNRA_100395 inhibits fibrosis-related genes in HAFs

3 討論

本文發(fā)現(xiàn)AF 病人的心耳組織纖維化程度顯著增加，芯片檢測結(jié)果顯示AF 病人心耳組織中circRNAs 表達(dá)譜發(fā)生顯著改變。RT-qPCR 實驗證實circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20 在纖維化的心耳組織中表達(dá)降低，而在AngⅡ誘導(dǎo)HAFs中表達(dá)升高。我們既往也有類似的發(fā)現(xiàn)，在Ang-Ⅱ灌注誘導(dǎo)重構(gòu)的小鼠心肌中miR-214-3p 表達(dá)下調(diào)，而在Ang-Ⅱ處理的小鼠心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞中miR-214-3p 上調(diào)［17-18］。本文結(jié)果顯示在發(fā)生心肌纖維化的整體和細(xì)胞水平上，circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20 的表達(dá)特征不同；在Ang-Ⅱ單一因素誘導(dǎo)的HAFs 中circRNA_100395 和KLHL20 mRNA 表達(dá)升高，而在AF 病人心耳組織中circRNA_100395 和KLHL20 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，這種在整體水平的表達(dá)降低可能是在腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統(tǒng)激活、炎癥和氧化應(yīng)激等多種病理因素綜合作用下的結(jié)果，但具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實。

通過對HAFs 進(jìn)行細(xì)胞核/質(zhì)RNA 分離和RTqPCR 檢測，我們證實circRNA_100395 主要存在于HAFs 的胞質(zhì)中，并且具有很好的RNA 穩(wěn)定性。為研究circRNA_100395 對心肌纖維化的調(diào)控作用，我們利用腺病毒介導(dǎo)在HAFs 中有效過表達(dá)circRNA_100395，但同時并未影響其宿主基因KLHL20 的表達(dá)。RNA 和蛋白水平的檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNA_100395 可顯著降低HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)，證實circRNA_100395 具有抑制心肌纖維化的作用，并且circRNA_100395 發(fā)揮生物學(xué)作用不是通過調(diào)控宿主基因KLHL20 表達(dá)的方式來實現(xiàn)的。

圖4 CircRNA_100395 通過結(jié)合miR-144-3p 發(fā)揮抑制心肌纖維化作用Fig.4 CircRNA-100395 inhibits myocardial fibrosis in HAFs via spondging miR-144-3p

以往研究表明，胞質(zhì)中富集存在的circRNA 可以通過結(jié)合特異的miRNA來發(fā)揮生物學(xué)作用［13，19］。鑒于circRNA_100395 是在HAFs 胞質(zhì)中富集存在，我們推測circRNA_100395 可能通過特異結(jié)合與纖維化調(diào)控相關(guān)miRNAs 的途徑來發(fā)揮生物學(xué)作用。Chen等人發(fā)現(xiàn)circRNA_100395可以通過結(jié)合miR-1228 調(diào)控miR-1228/TCF21 信號軸，負(fù)性調(diào)控肺癌細(xì)胞的增長，從而起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用［20］。本文中，我們預(yù)測circRNA_100395 上存在可與miR-144-3p 結(jié)合的潛在位點，并通過雙熒光酶報告基因?qū)嶒灪蚏NA pull-down 實驗證實了兩者間的結(jié)合作用。有文獻(xiàn)報道，miR-144-3p可靶向結(jié)合宿主基因第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN），抑制PTEN 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，上調(diào)纖維化相關(guān)基因α-SMA，COL1A1和COL3A1的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)心肌纖維化的作用［21］。本文結(jié)果顯示，miR-144-3p 可促進(jìn)HAF 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)，而circRNA_100395 可通過特異吸附miR-144-3p 來發(fā)揮抑制HAF 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用，但PTEN 是否參與介導(dǎo)circRNA_100395 抑制纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用，仍需進(jìn)一步的實驗證實。

綜上，本文發(fā)現(xiàn)在AF 病人的心耳組織中cir?cRNA_100395表達(dá)明顯下調(diào)，circRNA_100395主要存在于HAFs 胞質(zhì)中；circRNA_100395 可通過特異結(jié)合miR-144-3p 來發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用。接下來，我們將繼續(xù)研究介導(dǎo)circRNA_100395 發(fā)揮抑制心肌纖維化作用的miR-144-3p 下游靶基因，在細(xì)胞和整體動物水平明確miR-144-3p 介導(dǎo)circRNA_100395 發(fā)揮抑制心肌纖維化作用的分子機(jī)制，為以circRNA_100395 為靶點的心肌纖維化治療研究提供科學(xué)依據(jù)。