張 強 段艷文 楊翠紅

精神分裂癥(Schizophrenia)為一種患病率、復(fù)發(fā)率與致殘率均較高的慢性精神障礙性疾病，患者社會功能受損，以思維、情感及行為等障礙與精神活動不協(xié)調(diào)為主要表現(xiàn)，即使采用最有效的抗精神病藥物治療，仍有25%～50%的患者存在精神病性癥狀[1]。關(guān)于精神分裂癥的發(fā)病機制目前尚未明確，較多研究[2～4]均表明精神分裂癥的發(fā)病中有多巴胺、去甲腎上腺素、Dysbindin等基因參與。磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)是多巴胺D2受體(DRD2)重要下游細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，與精神分裂癥發(fā)病中多巴胺、去甲腎上腺素等基因下游信號的傳導(dǎo)有密切關(guān)系，亦是抗精神病藥物及情緒穩(wěn)定劑起效的穩(wěn)定性靶點，其中PI3K信號通路障礙與精神分裂癥發(fā)病機制相關(guān)，如精神分裂癥患者家族基因關(guān)聯(lián)研究[5]報道PI3KCB基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險增高相關(guān)。本研究主要分析不同病情精神分裂癥患者PI3K-AKT基因表達與臨床癥狀的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年11月～2018年12月聊城市第四人民醫(yī)院收治的90例精神分裂癥患者作為研究對象。入組標(biāo)準：(1)符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版修訂版(DSM-IV-TR)關(guān)于精神分裂癥的診斷標(biāo)準[6]，即至少滿足以下兩項癥狀標(biāo)準：①有反復(fù)性的言語性幻聽；②明顯的思維松弛、思維破裂、言語不連貫或者思維貧乏、思維內(nèi)容貧乏；③思維被插入，感覺有一種思維突然在自己思維里出現(xiàn)；④思維被洞悉、被控制；⑤有原發(fā)性妄想，包括被害妄想或被盜、被洞悉情況；⑥思維邏輯倒錯、病理性象征性思維或語詞新作，將一些較普通的言語賦予特別含義，情感倒錯、緊張、愚蠢行為、明顯的意志減退、缺乏；(2)陽性和陰性綜合征量表(PANSS)得分≥90分；(3)無藥物濫用記錄，且自愿參與本次研究，患者及法定監(jiān)護人簽署知情同意相關(guān)文件。排除標(biāo)準：有電休克治療史或煙酒等物質(zhì)依賴史、藥物濫用史；DSM-Ⅳ-TR診斷為其他精神性疾?。缓喜⒚庖咝约膊』蚪?個月內(nèi)有重大手術(shù)史、輸血史；合并急慢性感染、炎癥、服用免疫抑制劑者。其中急性精神分裂癥(呈急性起病，且主要表現(xiàn)為幻覺、妄想、思維紊亂、多疑、有牽連觀念及被害妄想，思維被大聲說出來)患者50例，納入急性組，慢性精神分裂癥(長期服藥，DSM-Ⅳ-TR殘留精神分裂癥亞型的精神分裂癥亞型或殘余精神分裂癥亞型，主要表現(xiàn)為情感淡漠、意志缺乏、動作遲緩及社會退縮)患者40例，納入慢性組，慢性組總病程>2年，入組時服用氯氮平至少6個月，達治療劑量。另選擇同期于體檢中心體檢的健康志愿者30名為對照組，均無藥物濫用史、精神疾病、免疫性疾病或重大手術(shù)史、神經(jīng)心理疾病史。急性組中男26例，女24例，平均年齡(33.78±3.59)歲；慢性組中男23例，女17例，平均年齡(50.14±5.23)歲；對照組中男15名，女15名，平均年齡(28.97±3.06)歲。三組性別構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而年齡比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=274.164，P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 均于清晨抽取空腹靜脈血2 ml，其中急性組血液采集需在藥物治療前完成，全血采集后3 h內(nèi)完成總RNA提取，后凍存在-80℃冰箱中。

1.2.2 臨床癥狀評估 PANSS及個體與社會表現(xiàn)量表(PSP)評估：在采血的當(dāng)天8：30～10：30 am，由1名固定主治醫(yī)師在詢問患者病史或進行精神檢查后行單盲法評定。以PANSS[7]評估其陽性與陰性癥狀，PANSS量表共含30項及3個補充項目評定攻擊危險性，分為陽性癥狀、陰性癥狀、一般精神病理學(xué)3個分量表，得分越高，癥狀越嚴重；應(yīng)用PSP評估其社會功能，PSP量表含4個領(lǐng)域，總分0～100分，得分越高社會功能越低下。

1.2.3 PI3K-AKT基因表達水平測定 (1)提取總RNA：采用吸附柱法試劑盒將總RNA提取出，應(yīng)用紫外分光光度法對RNA的濃度及純度進行測定，采用1.5%的瓊脂糖凝膠在180 mV下電泳5 min，對RNA完整性進行判定。(2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)與相對定量評估：將400 ng的總RNA作為轉(zhuǎn)錄模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Oligo d(T)作為引物合成cDNA，反應(yīng)混合物放置于42 ℃的水浴中，反應(yīng)20 min后在95 ℃的水浴中放置3 min以使反應(yīng)終止，后將反應(yīng)所得到的生成物放置于-80 ℃保存待測。采用QuantiFast Probe Assays(購自QiagenCo,Germany)與QuantiFast Probe PCR Kit(購自Qiagen Co,Germany)、ABI Prism 7500型PCR儀(購自美國ABI公司)予以實時qRT-PCR。探針測定包括AKT1引物、Hs AKT1P QF1 QuantiFast與PI3KCB引物、Hs PI3KCB QF1 QuantiFast，應(yīng)用GADPH引物及探針為內(nèi)部對照，PCR反應(yīng)體系的總體積25 μl，反應(yīng)條件為40個循環(huán)，首先94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，均平行測定3次后獲取平均Ct值，按Ct值對斜率及截距進行計算，并繪制標(biāo)準曲線。采用雙標(biāo)準曲線法對PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA表達水平進行分析。分析各組PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA水平相關(guān)性，同時分析精神分裂癥患者中PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA的表達水平和PANSS評分及PSP評分相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平分析 三組間PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平比較差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，急性組PI3KCB mRNA表達水平低于對照組(P<0.05)，急性組AKT1 mRNA表達水平高于慢性組、對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組外周血PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平分析

2.2 急性組、慢性組PANSS、PSP評分比較 急性組、慢性組的PANSS、PSP評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 急性組、慢性組PANSS、PSP評分比較

2.3 三組PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，急性組、對照組中PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平無相關(guān)性(r1=0.165，P1>0.05;r2=0.137，P2>0.05)，而慢性組中PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.389，P<0.05)。

2.4 急性組、慢性組PI3K-AKT基因表達水平與臨床癥狀的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，急性組、慢性組PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA表達水平與PANSS、PSP評分均無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 急性組、慢性組PI3K-AKT基因表達水平與臨床癥狀的相關(guān)性分析

3 討論

精神分裂癥為一種病因未明、反復(fù)發(fā)作、致殘率高的重性精神疾病，患者以幻覺、妄想等陽性癥狀，情感淡漠等陰性癥狀，學(xué)習(xí)、記憶功能受損等認知功能障礙為主要特征，至今尚未發(fā)現(xiàn)可靠的客觀生物學(xué)指標(biāo)對本病進行輔助診療[8]。PI3K-AKT信號通路為細胞內(nèi)調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、增殖、遷移與生存的主要信號通路，在許多病理生理活動中起著關(guān)鍵作用，尤其在神經(jīng)保護方面舉足輕重，其整體效應(yīng)為提高細胞復(fù)制與存活能力，且減弱生長阻滯與細胞凋亡，其過度激活與腫瘤發(fā)展、侵襲、預(yù)后差及耐受癌癥治療等有關(guān)[9，10]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路在皮質(zhì)發(fā)育畸形[11]、阿爾茨海默病[12]中起著重要作用，但目前關(guān)于PI3K-AKT信號通路在精神分裂癥病理生理過程中的作用研究較少。

本研究顯示，急性組PI3KCB mRNA表達水平低于對照組，這與劉亮等[13]的研究結(jié)果相似，表明急性精神分裂癥患者中PI3KCB mRNA呈低表達，PI3K參與精神分裂癥發(fā)病，可促進AKT同細胞膜結(jié)合，后使AKT繼續(xù)被磷酸化而激活，而AKT又參與細胞凋亡、細胞增殖等，在轉(zhuǎn)錄及細胞遷移中起著關(guān)鍵作用，是精神分裂癥可靠的生物標(biāo)志物，因而PI3K-AKT信號通路障礙可能同精神分裂癥發(fā)病有密切關(guān)系[14]。本研究慢性組與對照組的PI3KCB mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明長期采用氯氮平抗精神病藥物治療將PI3K控制到了與對照組相當(dāng)?shù)乃健１狙芯恳诧@示，急性組AKT1 mRNA表達水平高于慢性組及對照組，說明AKT與PI3K同時參與精神分裂癥發(fā)病。PI3K通常在生理狀態(tài)下被細胞外信號激活，如生長因子、細胞因子與激素等可能使其激活，之后的信號級聯(lián)反應(yīng)主要由AKT、核糖體蛋白S6激酶及糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的蛋白激酶等活化來調(diào)節(jié)[15]。AKT(包括AKT1、AKT2各亞型)是PI3K主要的下游效應(yīng)分子，為胰島素受體細胞內(nèi)信號的關(guān)鍵成分，參與不同細胞過程的調(diào)節(jié)[16，17]。在精神分裂癥患者發(fā)病過程中，PI3K-AKT是DRD2重要的下游細胞內(nèi)信號通路，參與多項精神分裂癥相關(guān)基因如多巴胺、5-羥色胺等的下游信號傳導(dǎo)，也是抗精神病藥物與情緒穩(wěn)定劑作用靶點；DRD2受體也能將PI3K-AKT信號通路活性進行下調(diào)，繼而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、生長與分化、代謝等作用，最終導(dǎo)致精神分裂癥。本研究也發(fā)現(xiàn)，慢性組與對照組的AKT1 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是因為慢性精神分裂癥患者已接受氯氮平(使用的藥物劑量已達到治療量)單藥治療≥6個月，在予以氯氮平治療后AKT水平已調(diào)節(jié)到與對照組水平持平的狀態(tài)。此外本研究中急性組、對照組中PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平無相關(guān)性，而慢性組中PI3KCB mRNA與AKT1 mRNA表達水平呈正相關(guān)，這與顧曙光等[18]的研究結(jié)果相似，表明長期采用氯氮平治療的慢性精神分裂癥患者AKT1表達可能已發(fā)生改變，繼而使PI3KCB與AKT1的mRNA表達相關(guān)性發(fā)生了變化[19]。

本研究也顯示急性組、慢性組的PANSS、PSP評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA表達水平與PANSS、PSP評分無相關(guān)性，說明PI3K-AKT信號通路有參與到精神分裂癥發(fā)病中，尤其在急性發(fā)病的精神分裂癥患者中較明顯，但抗精神病藥物會調(diào)節(jié)PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA的基因表達水平，并改善患者的精神癥狀，因而PI3K-AKT信號通路表達水平僅可作為精神分裂癥患者狀態(tài)指標(biāo)而非素質(zhì)指標(biāo)，這與既往王巍等[20]的研究結(jié)論一致。

當(dāng)然本研究也存在有研究樣本量小、未限制入組精神分裂癥患者疾病表型等局限性，因此后期有必要進一步擴大樣本量、從基因表達水平入手深入分析PI3K-AKT通路在精神分裂癥患者中作用機制。同時本次選取的急、慢性精神分裂癥患者，其年齡比較差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這是否對研究結(jié)果有影響未知，后期需進一步探討。

綜上所述，不同病情精神分裂癥患者PI3K-AKT信號通路基因表達水平存在差異，其中急性精神分裂癥與慢性精神分裂癥的AKT mRNA表達水平差異較明顯，但PI3K mRNA、AKT mRNA表達水平與臨床癥狀無相關(guān)性，長期應(yīng)用氯氮平行抗精神病治療可能影響PI3K-AKT基因的表達。