1.研究背景

感知并保護(hù)生物體免受傷害性刺激的能力依賴于感覺(jué)傳入神經(jīng)，這種感覺(jué)傳入神經(jīng)被稱為傷害性感受器。通常認(rèn)為傷害性感受器的神經(jīng)纖維是無(wú)髓鞘的，與之相連的Remak 膠質(zhì)細(xì)胞起到保護(hù)和支持神經(jīng)軸突代謝的作用。這種無(wú)髓神經(jīng)的末梢可以被傷害性刺激所激活，因此被稱作皮膚的痛覺(jué)感受器。該研究使用表達(dá)在神經(jīng)嵴并且是膠質(zhì)細(xì)胞特異的Cre 系小鼠與報(bào)告基因小鼠交配進(jìn)行遺傳學(xué)標(biāo)記，研究皮膚膠質(zhì)細(xì)胞（施萬(wàn)細(xì)胞）的分布及其與傷害性神經(jīng)末梢之間的相互聯(lián)系。

2. 主要研究方法

研究者主要使用Plp-CreERT2/+; R26REYFP/+(Plp-YFP)、Sox10CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox10-TOM) 和Sox2CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox2-TOM) 品系的小鼠，采用免疫熒光技術(shù)，借助熒光顯微鏡、透射電鏡及免疫電鏡觀察皮膚施萬(wàn)細(xì)胞分布情況及其與傷害性神經(jīng)末梢之間的相互聯(lián)系。

使用Plp-CreERT2/+; R26RChR2/+(Plp-ChR2)、Sox10CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox10-ChR2)、Sox2CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox2-ChR2) 和Sox-10CreERT2/+; R26R ArchT/+(Sox10-ArchT) 品系的小鼠，采用光遺傳技術(shù)操控施萬(wàn)細(xì)胞，觀察小鼠疼痛相關(guān)行為學(xué)變化。從外周組織分離培養(yǎng)末梢施萬(wàn)細(xì)胞，采用細(xì)胞外記錄及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)傷害性施萬(wàn)細(xì)胞的電學(xué)特征。

3. 主要研究結(jié)果

在Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠中，與神經(jīng)標(biāo)記物PGP9.5 染色的雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示無(wú)論是在有毛皮膚還是在無(wú)毛皮膚，施萬(wàn)細(xì)胞均處于真皮內(nèi)的相同位置，位于接近真皮/表皮邊界，并與上行性神經(jīng)纖維緊密接觸。此外PlpYFP+、SOX10+和S100b+細(xì)胞具有向表皮廣泛伸出的放射狀突起，這一特點(diǎn)與其他的施萬(wàn)細(xì)胞形態(tài)一致。透射電鏡結(jié)果顯示從施萬(wàn)細(xì)胞胞體發(fā)出的神經(jīng)末梢位于從真皮/表皮邊界到表皮層的幾微米之外，而且膠質(zhì)細(xì)胞是其唯一的胞質(zhì)性鞘膜。神經(jīng)纖維和施萬(wàn)細(xì)胞被一層厚的纖維性膠原所包圍。與其他膠原不同，這些膠原的方向與膠質(zhì)-神經(jīng)復(fù)合體的方向一致。這種形態(tài)特異的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)豐富的I 型水通道蛋白 (AQR-1)，并與CGRP+、P2RX3+、TRPV1+傷害性感受纖維共標(biāo)。免疫電鏡觀從超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)，Sox10-TOM 小鼠的TOMATO 紅色熒光存在于膠質(zhì)細(xì)胞中。因此，一種形態(tài)上和分子上特化的施萬(wàn)細(xì)胞（以下稱為傷害性施萬(wàn)細(xì)胞）在皮下邊緣層形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)與傷害性神經(jīng)纖維的密切聯(lián)系構(gòu)成膠質(zhì)-神經(jīng)復(fù)合體，并通過(guò)膠原纖維的結(jié)構(gòu)包繞而相互絕緣。

為了確定傷害性施萬(wàn)細(xì)胞是否介導(dǎo)疼痛的感知，研究者首先分析了Plp-YFP、Sox10-TOM 和Sox2-TOM 小鼠中傷害性施萬(wàn)細(xì)胞在不同膠質(zhì)細(xì)胞中的分布。Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠的熒光表達(dá)在傷害性施萬(wàn)細(xì)胞以及梅氏小體、毛囊刺樣結(jié)構(gòu)的終末施萬(wàn)細(xì)胞和神經(jīng)纖維的膠質(zhì)細(xì)胞中，但不在默克爾細(xì)胞或背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元外面的膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。相比之下，Sox2-TOM 小鼠的熒光不表達(dá)在傷害性施萬(wàn)細(xì)胞中，但是表達(dá)在其他Sox10-TOM 小鼠表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞和默克爾細(xì)胞中。因此，將這些小鼠與攜帶光敏感通道的小鼠雜交，所得到的雜交小鼠就可以被用于以下實(shí)驗(yàn)：在不直接刺激感覺(jué)神經(jīng)的情況下操控施萬(wàn)細(xì)胞的活動(dòng)，從而特異性地研究傷害性施萬(wàn)細(xì)胞的功能。

將Plp 和Sox10 小鼠與ChR2-eYFP 小鼠交配獲得Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠，目的是通過(guò)光遺傳的方法觀察激活傷害性施萬(wàn)細(xì)胞是否足以引起疼痛樣反應(yīng)。隨著刺激功率的增加，兩種品系小鼠均有輕度肢體回避行為。手掌部神經(jīng)的細(xì)胞外記錄顯示，神經(jīng)放電活動(dòng)隨著刺激手掌部皮膚的光強(qiáng)增加而增加，所記錄到的放電包括C 纖維的放電，也可能包括高振幅的A 類纖維簇狀放電。低閾值機(jī)械感受器 (LTMRs) 末端為毛囊的刺樣結(jié)構(gòu)，可支配默克爾細(xì)胞和梅氏小體，引起頭發(fā)彎曲、觸摸、壓力、顫動(dòng)或振動(dòng)，但不引起疼痛行為。然而在慢性疼痛中，輕觸激活的神經(jīng)元可導(dǎo)致觸誘發(fā)痛。與表現(xiàn)出刺激強(qiáng)度依賴的縮足反應(yīng)的Sox10-ChR2小鼠相比，刺激Sox2-ChR2 小鼠LTMR 的施萬(wàn)細(xì)胞不能引起小鼠縮足反應(yīng)，說(shuō)明LTMR 的施萬(wàn)細(xì)胞不參與痛行為。光刺激小鼠還引起舔爪、抖動(dòng)和護(hù)足等行為，說(shuō)明該縮足反應(yīng)的確是痛行為。

為了研究傷害性施萬(wàn)細(xì)胞調(diào)節(jié)感覺(jué)的模式，研究者將誘發(fā)動(dòng)物行為的光遺傳閾下刺激，與冷、熱和機(jī)械刺激相結(jié)合。這時(shí)，閾下光刺激可以使生理刺激所調(diào)節(jié)的行為變得敏感。閾下刺激顯著增加了2 g von Frey 的行為反應(yīng)；提高了Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠對(duì)冷刺激的反應(yīng)；但不影響棉簽引起的輕觸反應(yīng)。在Sox10-ArchT 小鼠中，沉默傷害性施萬(wàn)細(xì)胞不影響冷刺激的反應(yīng)。在Plp-ChR2和Sox10-ChR2 小鼠，閾下光刺激增強(qiáng)了熱誘發(fā)縮足反應(yīng)，但在Sox10-ArchT 小鼠沉默傷害性施萬(wàn)細(xì)胞并不影響熱痛閾。通過(guò)增加閾下光刺激的時(shí)長(zhǎng)，Plp-ChR2 小鼠的機(jī)械痛閾值表現(xiàn)出時(shí)間依賴性降低。在Sox10-ChR2 小鼠，沉默施萬(wàn)細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)械閾值顯著升高，24 h 后則恢復(fù)。

采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)表達(dá)Sox10-TOM 的傷害性施萬(wàn)細(xì)胞電學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

當(dāng)向細(xì)胞內(nèi)注入步階電流時(shí)，該細(xì)胞I-V 曲線在靜息膜電位周圍顯示出雙相線性關(guān)系，且在靜息電位周圍存在一個(gè)精確的拐點(diǎn)（靜息電位平均-32.56±1.36 mV）。該類細(xì)胞呈現(xiàn)去極化時(shí)阻抗降低，表明有內(nèi)在的離子通道打開，可將膜電位拉向靜息電位。被動(dòng)膜電學(xué)特性表明該細(xì)胞具有在神經(jīng)元的范圍內(nèi)較慢的時(shí)間常數(shù)。

研究者還測(cè)量了傷害性的施萬(wàn)細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的電反應(yīng)，以確定其是否具有機(jī)械活性。研究顯示，機(jī)械刺激可以使細(xì)胞產(chǎn)生瞬時(shí)的去極化(n = 9)。 其中4 個(gè)細(xì)胞可能由于機(jī)械力影響細(xì)胞的封接而沒(méi)有完全回到基線。剩余的5 個(gè)細(xì)胞中，在持續(xù)施加力的過(guò)程中細(xì)胞放電的衰減基本上是完全的，這表明機(jī)械感受性反應(yīng)在持續(xù)力的作用下產(chǎn)生了適應(yīng)。由于反應(yīng)和適應(yīng)都非常迅速，使隨后的刺激出現(xiàn)和前一個(gè)刺激類似的反應(yīng)。這些細(xì)胞放電可以跟隨實(shí)驗(yàn)者所給的最高刺激頻率(60 Hz)。此外，釋放機(jī)械力也可使細(xì)胞去極化，因此傷害性施萬(wàn)細(xì)胞對(duì)力的正負(fù)變化都有反應(yīng)，但對(duì)持續(xù)的力反應(yīng)要弱得多。傷害性施萬(wàn)細(xì)胞放電峰值平均幅度25.5±2.1 mV，半波寬6.7±1.5 ms，上升時(shí)間1.4±0.2 ms。機(jī)械感受器電位的這個(gè)時(shí)程說(shuō)明有機(jī)械感受器電流產(chǎn)生的可能。因此這些參數(shù)提示傷害性施萬(wàn)細(xì)胞存在類似于之前描述的感覺(jué)神經(jīng)元所屬的快的門控機(jī)制。

4. 討論

該研究為一種可以在皮膚上形成感覺(jué)器官、引起疼痛感覺(jué)的特殊類型的膠質(zhì)細(xì)胞提供了證據(jù)。該研究表明傷害性施萬(wàn)細(xì)胞在表皮下的神經(jīng)周圍形成網(wǎng)狀的胞質(zhì)鞘，呈放射狀突起進(jìn)入與無(wú)髓鞘傷害性神經(jīng)鄰接的表皮。傷害性施萬(wàn)細(xì)胞相當(dāng)于45 年前被忽略的位于表皮下邊界的Remak 施萬(wàn)細(xì)胞。而在當(dāng)時(shí)人們認(rèn)為神經(jīng)纖維失去了膠質(zhì)附著，以游離神經(jīng)末梢的形式進(jìn)入表皮。在這篇文章中，研究者證明傷害性施萬(wàn)細(xì)胞具有高度的機(jī)械敏感性，對(duì)正和負(fù)的機(jī)械力刺激都有反應(yīng)，與秀麗隱桿線蟲的“開-關(guān)”式機(jī)械感受器反應(yīng)相似，可將傷害性刺激轉(zhuǎn)為電信號(hào)然后再轉(zhuǎn)化為類似疼痛的行為。皮膚中的傷害性神經(jīng)末梢也會(huì)對(duì)各種有害刺激產(chǎn)生反應(yīng)。因此，傷害性神經(jīng)和傷害性施萬(wàn)細(xì)胞形成一個(gè)傷害性膠質(zhì)-神經(jīng)復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體有兩種感覺(jué)受體細(xì)胞類型：膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，都可能影響痛覺(jué)。大多數(shù)或所有類型的傷害性感受器似乎都參與了膠質(zhì)-神經(jīng)復(fù)合體的活動(dòng)，而且在功能獲得性 (gain of function) 實(shí)驗(yàn)中，機(jī)械性痛覺(jué)和熱痛覺(jué)都增強(qiáng)了。然而，在功能喪失性 (loss of function) 實(shí)驗(yàn)中，小鼠的熱痛覺(jué)并不受影響，推測(cè)初級(jí)傳入神經(jīng)本身就有足夠的溫度敏感離子通道的激活，或者傷害性施萬(wàn)細(xì)胞參與了研究者在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有捕捉到的其他溫度敏感性行為。與溫度敏感性行為相反，小鼠機(jī)械閾值在功能性增加和功能性喪失的實(shí)驗(yàn)中都受到了影響，說(shuō)明傷害性施萬(wàn)細(xì)胞在生理上對(duì)機(jī)械刺激的感覺(jué)起作用，這可能提示不同的傷害性神經(jīng)元類型的反應(yīng)譜比分子譜預(yù)測(cè)得更為廣泛。如果不同的神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞傳導(dǎo)不同的溫度和機(jī)械刺激，如已知的默克爾細(xì)胞傳導(dǎo)非傷害觸覺(jué)，那么研究者的發(fā)現(xiàn)具有廣泛功能上的意義。

（Abdo H, Calvo-Enrique L, Lopez JM, et al. Specialized cutaneous Schwann cells initiate pain sensation. Science, 2019, 16, 365:696-699. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，王婷婷 譯, 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，張玲 校）