郭小燕，張海樓，夏寶妹，陶偉偉，李文佳，徐聯(lián)調(diào)，沈琴琴，鄒之璐，陳剛

(南京中醫(yī)藥大學轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學與神經(jīng)科學研究中心，中醫(yī)腦病研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

阿爾茨海默病(AD)是一種以淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和認知功能損害為主要特征的神經(jīng)退行性腦疾病[1]。其一線治療藥物主要是以多奈哌齊為代表的乙酰膽堿酯酶抑制劑及美金剛為代表的NMDA受體拮抗劑[2]。然而，由于這些藥物靶點單一、療效低且具有頭暈、頭痛、嗜睡、肝毒性、胃腸功能障礙等副作用，尋找更安全、快速、有效的藥物成為AD治療的迫切需求[3-4]。

鑒于Aβ斑塊在AD病理學中的重要作用，β-淀粉樣蛋白(或Aβ級聯(lián))假說多年來一直主導AD研究領(lǐng)域[5]。然而，大量的Aβ靶向治療在臨床試驗中失敗，使AD研究轉(zhuǎn)向了磷酸化TAU的清除和突觸可塑性增強等新靶點[6]。此外，以多靶點為特征的中醫(yī)藥受到越來越多的關(guān)注[7]。中醫(yī)藥治療癡呆具有悠久的歷史，現(xiàn)代研究表明其對治療老年癡呆癥患者具有明顯的療效和安全性，是AD治療的重大潛力[8-10]。

從中醫(yī)角度，AD為本虛標實的疾病，而多見腎虛髓虧為本、痰蒙腦竅為標。補腎益精填髓、豁痰開竅是中醫(yī)治療AD的重要治法。好忘方出自于唐代著名醫(yī)家孫思邈《備急千金要方》，由續(xù)斷、肉蓯蓉、遠志、茯苓、菖蒲組成，是益精填髓與豁痰開竅并用的治療健忘的經(jīng)典方劑，但其應(yīng)用于AD的治療研究還相對缺乏[11]。

TAU蛋白病變和突觸可塑性的異常是AD的重要特征，二者皆可導致認知損害[12-13]。有研究報道，補腎化痰方藥可通過失活AD模型大鼠的GSK3β，從而降低磷酸化TAU的蛋白水平[14]。此外，一些獨立研究發(fā)現(xiàn)過度磷酸化的TAU與突觸可塑性損傷密切相關(guān)，其可能是AD和其他TAU蛋白病的突觸損傷的實施者[15]。cAMP依賴性蛋白激酶PKA，對神經(jīng)元分化、存活、活動、可塑性及學習和記憶具有重要作用[16]。PKA可激活GSK3β-Ser9，減少TAU的過度磷酸化，也可磷酸化CREB，提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及突觸蛋白SYNAPSIN1、GLUR1、PSD95的蛋白水平[17-19]。BDNF在神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)釋放、樹突重塑和軸突生長過程中起著至關(guān)重要的作用，是促進突觸可塑性的重要分子[20-21]。

本研究探索了好忘方對AD小鼠模型：東莨菪堿模型和SAMP8模型的認知改善作用及其與PKA介導的磷酸化TAU的清除和突觸可塑性的增強作用的聯(lián)系。

1 材料

1.1 實驗動物

20～25 g雄性ICR小鼠及C57BL/6J小鼠由常州卡文斯實驗動物有限公司提供,動物許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。雄性SAMP8小鼠由北京大學提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0010。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學與神經(jīng)科學研究中心SPF級動物屏障房內(nèi)。東莨菪堿實驗中，小鼠飼養(yǎng)1周后開始實驗；SAMP8實驗中，小鼠飼養(yǎng)至5月齡開始實驗。動物房室溫22～24 ℃，明暗交替時間為12 h，動物可自由飲食進水。所有動物實驗均符合南京中醫(yī)藥大學動物管理與使用委員會批準的實驗動物管理和使用指南。

1.2 藥物

實驗藥物購于南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診部。好忘方主要藥物組成為續(xù)斷、肉蓯蓉、茯苓、遠志、菖蒲，按8∶8∶3∶3∶3用量。將上述5種藥材粉碎，過100目篩，混合后浸泡于95%乙醇中(6倍體積)24 h，期間不停攪拌，靜置后取上清。該過程重復2次。將收集到的上清液過濾并減壓濃縮至無乙醇。灌胃給藥時，使用0.9%生理鹽水配成0.41 mg/mL濃度。鹽酸多奈哌齊片由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，使用0.9%生理鹽水配成0.5 mg/mL(東莨菪堿實驗)和0.3 mg/mL(SAMP8實驗)備用。氫溴酸東莨菪堿由南京良緯公司提供，使用0.9%生理鹽水配成0.1 mg/mL備用。

2 方法

2.1 實驗分組與給藥

東莨菪堿實驗：將雄性ICR小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、好忘方組、多奈哌齊組。各組給予7 d的灌胃給藥治療，空白對照組和模型對照組給予0.9%的生理鹽水。在3～7 d，小鼠灌胃給藥1 h后腹腔注射1 mg/kg的東莨菪堿造模，空白對照組腹腔注射生理鹽水。灌胃給藥劑量：好忘方組4.1 g/kg，多奈哌齊組5 mg/kg。

SAMP8實驗：將5月齡雄性SAMP8小鼠分為模型對照組、好忘方組、多奈哌齊組，并選用同年齡大小的雄性C57BL/6J小鼠作為空白對照。小鼠連續(xù)灌胃給藥3周。給藥劑量：好忘方4.1 g/kg，多奈哌齊3 mg/kg。

2.2 行為測試

2.2.1 Morris水迷宮(MWM) 迷宮是一個注有水(24±1)℃的圓形水池(直徑150 cm，高50 cm)。迷宮分為4個象限，在其中一個象限水下1 cm處放置直徑10 cm的站臺。小鼠連續(xù)訓練4 d，每天訓練2個象限。訓練時，將小鼠面朝壁放入水中，若小鼠在60 s內(nèi)找到站臺,則讓其在站臺待10 s。若不能找到站臺，則將其引至站臺，并讓其站臺待10 s。第5天，先進行定位導航測試：將小鼠面朝壁從站臺鄰近象限放入水中60 s，記錄小鼠從入水至上站臺的潛伏期。3 h后進行空間探索測試：撤除平臺，將小鼠從離站臺最遠象限面朝外壁放入池中,記錄60 s內(nèi)小鼠在站臺所在象限游泳的路程百分比和穿越平臺位置的次數(shù)。

2.2.2 新物體識別(NOR) 在46 cm×30 cm×16 cm的開場兩端的中間放置兩個形狀、顏色、材質(zhì)相同的物體。將小鼠放置于開場中熟悉物體10 min。6 h后，將開場中的一個物體替換為形狀、顏色、材質(zhì)不同的新物體，然后將小鼠置于開場中5 min，記錄小鼠探索新舊物體的次數(shù)。檢測指標：新物體識別指數(shù)=探索新物體的次數(shù)/探索新舊物體的總次數(shù)。

2.3 Western blot實驗

小鼠行為學測試結(jié)束后，立即進行冰上取腦，分離海馬組織。將海馬組織稱質(zhì)量并置于裂解液中勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，用Nanodrop(Thermo)測定樣品蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，取2 μL樣品/泳道上樣，根據(jù)蛋白分子量選擇分離膠(10%或15%)分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，3%BSA室溫封閉膜1 h，隨后分別加入PKA(Cell Signaling Technology，1∶3 000)，GSK3β-Ser9(Cell Signaling Technology，1∶20 000)，GSK3β(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TAU-Ser404(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TAU(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，p-CREB(Cell Signaling Technology，1∶500)，CREB(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，BDNF(Santa Cruz Biotechnology，1∶200)，SYNAPSIN1(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，GLUR1(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，PSD95(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TUBLIN(Cell Signaling Technology，1∶5 000)，GAPDH(Cell Signaling Technology，1∶5 000)。4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗10 min×3次后，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST漂洗10 min×3次，加入ECL發(fā)光底物顯色。全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影分析(Tanon 5200)。用目的蛋白與各自TUBLIN或GAPDH蛋白灰度比值表示其相對蛋白量。實驗重復3次。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 好忘方改善東莨菪堿模型小鼠認知障礙

經(jīng)東莨菪堿造模后，MWM測試中，模型小鼠與空白對照組相比，逃避潛伏期明顯上升，站臺穿越次數(shù)顯著下降。好忘方和多奈哌齊治療皆可顯著提升小鼠站臺穿越次數(shù)(P<0.01)。給藥1周后，逃避潛伏期方面，模型對照組和多奈哌齊組與空白對照組相比，仍具顯著差異。好忘方組與空白對照組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖1。

3.2 好忘方改善SAMP8小鼠認知障礙

5月齡雄性SAMP8小鼠與同齡對照雄性C57BL/6J小鼠每天分別給予好忘方和多奈哌齊治療，連續(xù)給藥3周。第17～20天給藥結(jié)束1 h后，進行MWM訓練。第21天進行MWM測試，第22天進行NOR測試。MWM測試中，與空白對照組相比，模型對照組逃避潛伏期明顯增長(P<0.01，圖2a)，站臺穿越次數(shù)(P<0.01，圖2b)和目標象限路程比(P<0.05，圖2c)顯著降低。NOR測試中，與空白對照組相比，模型對照組新物體識別指數(shù)明顯下降(P<0.01，圖2d)。好忘方和多奈哌齊給藥治療均可顯著縮短小鼠MWM逃避潛伏期(P<0.01)，提升NOR指數(shù)(P<0.05)。此外，好忘方可提高MWM目標象限比，且在縮短逃避潛伏期方面，優(yōu)于多奈哌齊(P<0.05)。

3.3 好忘方逆轉(zhuǎn)SAMP8模型小鼠海馬區(qū)PKA-GSK3β-TAU通路表達

與空白對照組相比，模型對照組海馬中PKA(P<0.01，圖3a)、GSK3β-Ser9(P<0.01，圖3b)蛋白水平顯著降低，TAU-Ser404(P<0.01，圖3c)水平明顯上升。好忘方與多奈哌齊治療顯著提高了SAMP8小鼠GSK3β-Ser9(P<0.05)蛋白水平，降低了TAU-Ser404(P<0.01)蛋白水平。此外，治療后，好忘方組GSK3β-Ser9水平明顯高于多奈哌齊組(P<0.01)。

3.4 好忘方逆轉(zhuǎn)SAMP8模型小鼠海馬區(qū)PKA-CREB通路表達

與空白對照組相比，模型對照組海馬p-CREB(P<0.05，圖4a)及其下游BDNF(P<0.01，圖4b)和突觸蛋白SYNAPSIN1(P<0.01，圖4c)、GLUR1(P<0.01，圖4d)、PSD95(P<0.01，圖4e)蛋白水平均顯著下降。好忘方和多奈哌齊治療均能顯著逆轉(zhuǎn)以上蛋白的下調(diào)(P<0.01)。

4 討論

AD是常見的神經(jīng)退行性疾病，占癡呆總數(shù)的50%～70%。根據(jù)AD世界報告，2015年全球有4 680萬AD患者，預計到2050年將增加到1.315億[22]。目前我國AD患者已達到600萬，且隨著人口老齡化的加劇，發(fā)病率將呈逐漸上升趨勢，給社會和家庭帶來巨大的影響[23]。由于AD主流治療藥物不能延緩疾病進程，且伴有肝毒性等不良反應(yīng)，尋求切實有效的治療方法，具有重要的意義[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)經(jīng)典方劑好忘方可顯著提升東莨菪堿模型小鼠MWM站臺穿越次數(shù)，逆轉(zhuǎn)SAMP8模型小鼠在MWM中逃避潛伏期的延長，站臺穿越次數(shù)和目標象限路程比的減少及NOR指數(shù)的下降，上調(diào)SAMP8小鼠PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路的蛋白水平。

本實驗使用了兩種AD動物模型：東莨菪堿小鼠模型和SAMP8小鼠模型。東莨菪堿是一種毒蕈堿性乙酰膽堿受體阻滯劑，可誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能信號的失調(diào)，導致認知缺陷[25]。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的大腦表現(xiàn)出膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的明顯損傷，乙酰膽堿酯酶活性增加[26]。因此東莨菪堿誘導的健忘癥模型被廣泛用于探索記憶功能障礙。SAMP8小鼠因其呈現(xiàn)出皮質(zhì)萎縮，神經(jīng)元細胞丟失，神經(jīng)膠質(zhì)增生，氧化應(yīng)激，Aβ蛋白水平升高，TAU過度磷酸化，學習和記憶缺陷等與AD相似的病理癥狀，是研究AD較為理想的動物模型[27-28]。Morris水迷宮是基于嚙齒類動物對水中游泳的厭惡而產(chǎn)生逃生本能，并要求動物依據(jù)視覺空間線索，找到水下平臺位置的測試，是經(jīng)典的評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力的檢測方法[29]。新物體識別測試是檢測小鼠視覺記憶的重要測試。本研究中，東莨菪堿模型小鼠出現(xiàn)MWM逃避潛伏期延長和站臺穿越次數(shù)減少，提示模型小鼠已出現(xiàn)認知損害，而給予好忘方治療后，造模小鼠站臺穿越次數(shù)顯著上升，說明好忘方具有改善空間記憶功能的效果。SAMP8模型中，模型小鼠在Morris水迷宮和新物體識別測試中均呈現(xiàn)認知損害，說明小鼠空間記憶能力和視覺認知皆受損，這與研究報道的5月齡SAMP8小鼠已經(jīng)呈現(xiàn)出AD方面的認知損害較為一致[30]。研究發(fā)現(xiàn)，好忘方給藥后逆轉(zhuǎn)了SAMP8小鼠在Morris水迷宮和NOR識別方面的認知損害，揭示出好忘方具有改善AD模型小鼠空間記憶和視覺記憶的作用。此外，好忘方組在縮短MWM逃避潛伏期方面明顯優(yōu)于多奈哌齊組，這說明好忘方在改善小鼠空間記憶障礙方面可能優(yōu)于多奈哌齊。目前AD藥物研究中，在逆轉(zhuǎn)AD小鼠模型認知損害方面具有與多奈哌齊相似療效的藥物較為常見，但治療效果明顯優(yōu)于多奈哌齊的藥物較為少見[31-34]。

磷酸化TAU蛋白是AD最突出的病理標志物之一神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的主要成分。TAU-Ser404是NFT主要纖維成分成對螺旋長絲中的主要位點[35]。異常TAU蛋白不僅失去其正常的生理功能，其沉積更會產(chǎn)生新的毒性，且引起AD患者的認知功能下降[36-38]。突觸可塑性是指腦內(nèi)學習記憶的編碼和儲存時突觸在數(shù)量、結(jié)構(gòu)以及功能上發(fā)生的有序變化[39]。過磷酸化TAU和突觸可塑性損害是AD重要的病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，過磷酸化TAU可能是造成AD突觸可塑性損害的重要原因。好忘方給藥后，逆轉(zhuǎn)了PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路的蛋白水平。已有研究報道，補腎化痰方對GSK3β-TAU通路具有調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于其同時改善AD模型動物PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路報道尚為罕見。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)經(jīng)典補腎化痰方劑好忘方可以有效改善AD模型小鼠的認知障礙，而這種改善作用與PKA介導的磷酸化TAU的清除及突觸可塑性的增強作用有關(guān)。