鄭麗婷，周鴻，劉奕明，2，林愛(ài)華

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510120)

糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主的慢性綜合性疾病，它的死亡率僅次于腫瘤和心腦血管疾病，位居第三[1]。降糖藥可通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌，促進(jìn)外周組織攝取葡萄糖，抑制糖異生，增強(qiáng)胰島素敏感性,抑制人體消化道對(duì)糖類的吸收等治療和控制糖尿病及其并發(fā)癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，餐后高血糖是糖尿病發(fā)病過(guò)程中最先出現(xiàn)的癥狀，能夠誘發(fā)各種并發(fā)癥，提高糖尿病患者的死亡率[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑能通過(guò)抑制小腸上皮細(xì)胞絨毛膜上的α-葡萄糖苷酶的活性，延緩對(duì)葡萄糖的吸收，控制餐后血糖的升高，有助于防治2型糖尿病及其并發(fā)癥[3]。近年來(lái)從藥用植物中篩選天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)[4-6]。

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)的干燥樹(shù)皮?，F(xiàn)代研究表明黃柏具有降血糖、抗氧化、抗炎、降壓、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。黃柏堿是黃柏的特征性成分和重要活性成分之一,在降血壓、抗腎炎、抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)和中樞抑制等方面具有顯著效果[7-8]。黃柏堿是否具有降糖相關(guān)作用而成為黃柏降血糖活性物質(zhì)尚未見(jiàn)報(bào)道,故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立α-葡萄糖苷酶體外篩選模型，初步探討黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響及其作用類型；采用同源模建的方法構(gòu)建來(lái)源于釀酒酵母的α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，并借助分子對(duì)接的方法嘗試性地闡釋黃柏堿抑制α-葡萄糖苷酶的機(jī)制，以期為后續(xù)探討黃柏堿降糖作用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑

鹽酸黃柏堿對(duì)照品，純度99.44%，批號(hào)：MUST-17112110，成都曼斯特生物科技有限公司；阿卡波糖，純度95%，批號(hào)：S11190，上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(釀酒酵母)，批號(hào)：S10050，上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，批號(hào)：S10137，上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀，批號(hào)：S24278，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉，分析純，批號(hào)：20171101-1，廣州化學(xué)試劑廠；無(wú)水碳酸鈉，分析純，批號(hào)：20000601-1，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司)；ZXDP-B2050電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；PL303千分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；MS105DU十萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；MS3數(shù)顯型旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司)；SI4002多微孔板振蕩器(廣州市浩瀚有限公司)。

2 方法

2.1 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL,加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液118 mL,用純水稀釋至1 000 mL，搖勻即得。

α-葡萄糖苷酶溶液：稱取適量α-葡萄糖苷酶粉末，用磷酸鹽緩沖液溶解定容，配成2 U/mL的母液，用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。

PNPG溶液：精密稱取188.31 mg，先加1 mL DMSO溶解，再加磷酸鹽緩沖液定容至25 mL，配制成25 mmol/L的母液，用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。

黃柏堿溶液：精密稱取9.99 mg，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至5 mL，配制成濃度為2 000 mg/L的母液，用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。

阿卡波糖溶液：精密稱取5.04 mg，用純水溶解并定容至5 mL，配制成1 000 mg/L的母液，用純水稀釋至所需濃度。

碳酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取5.30 g，加250 mL蒸餾水溶解，配制成0.2 mol/L碳酸鈉溶液。

2.2 黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

以PNPG為底物，阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)分為空白組(不加黃柏堿和α-葡萄糖苷酶液)、對(duì)照組(不加黃柏堿)、黃柏堿測(cè)定組、黃柏堿空白組(不加α-葡萄糖苷酶液)、陽(yáng)性對(duì)照組和陽(yáng)性空白組(不加α-葡萄糖苷酶液)。反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[9]方法，在96微孔板中加入適量(根據(jù)反應(yīng)終止時(shí)體積為200 μL計(jì)算)磷酸鹽緩沖液，0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL和樣品溶液20 μL(反應(yīng)體系中黃柏堿終濃度分別為20、50、100、150、200 mg/L；阿卡波糖的終濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L)，低速振蕩混勻，37 ℃放置10 min，加入10 mmol/L PNPG 20 μL，低速振蕩混勻，37 ℃反應(yīng)20 min，再加入0.2 mol/L的碳酸鈉溶液80 μL終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光值。按下式計(jì)算目標(biāo)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

Ac為對(duì)照組，Ab為空白組，As為樣品組，Asb為樣品空白組。

2.3 黃柏堿的酶抑制作用類型

2.3.1 可逆或不可逆抑制作用 選取反應(yīng)后具有明顯吸光度變化的酶濃度0.125、0.25、0.5 U/mL，并選取最大酶量的飽和底物濃度10 mmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(1 000、2 000 mg/L黃柏堿,加入到反應(yīng)體系后對(duì)應(yīng)的終濃度分別為166.67、333.33 mg/L)和對(duì)照組(不加黃柏堿)，反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[10]的方法，于96孔板加入磷酸鹽緩沖液60 μL，酶液20 μL和黃柏堿溶液20 μL，低速振蕩混勻，37 ℃放置10 min，加入10 mmol/L PNPG 20 μL，低速振蕩混勻，37 ℃反應(yīng)20 min，于波長(zhǎng)405 nm下讀取吸光值A(chǔ)1，將96孔板放回恒溫箱繼續(xù)放置10 min，于波長(zhǎng)405 nm下讀取吸光值A(chǔ)2，以α-葡萄糖苷酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，其中反應(yīng)速率為V，由下式求出，ΔT為10 min。

2.3.2 可逆抑制作用的類型 選取0.5 U/mL酶濃度，并選取有梯度的底物濃度2.5、5、10、20 mmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(500、1 000 mg/L黃柏堿，加入到反應(yīng)體系后對(duì)應(yīng)的終濃度分別為83.33、166.67 mg/L)和對(duì)照組(不加黃柏堿)，參照“2.3.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，分別繪制不同濃度黃柏堿的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線，確定抑制類型，由公式(1)求出最大反應(yīng)速度Vmax和米氏常數(shù)Km。其中反應(yīng)速率的倒數(shù)為1/V，由公式(2)求出，ΔT為10 min。

2.4 分子對(duì)接分析

2.4.1 同源建模及合理化評(píng)估 采用同源模建的方法構(gòu)建釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)。首先從UniProt蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)獲得釀酒酵母α-葡萄糖苷酶MAL12(P53341)的一級(jí)序列。將MAL12氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org/)匹配獲得同源性最高的蛋白序列，若其相似性高于30%，則可作為MAL12建模模板，并可進(jìn)一步對(duì)其蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。為了確保MAL12的模型質(zhì)量，結(jié)合SWISS-MODEL和UCLA-DOE服務(wù)器(https://www.doe-mbi.ucla.edu/)對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，主要以GMQE(可信度范圍為0～1，值越大表明質(zhì)量越好)[11]、QMEAN(評(píng)價(jià)區(qū)間為-4～0，越接近0，評(píng)估待測(cè)蛋白與模板蛋白的匹配度越好)[12]、Verify-3D(超過(guò)80%的殘基擁有大于0.2的3D/1D值，則模型質(zhì)量合格)[13]、PROCHECK(合格值為90%)[14]指標(biāo)和程序檢驗(yàn)?zāi)Ｐ唾|(zhì)量的得分值，為分子對(duì)接所需蛋白模型的合理性提供依據(jù)。

2.4.2 分子文件準(zhǔn)備及分子對(duì)接 利用Chemdraw Ultra 14.0繪畫(huà)黃柏堿和阿卡波糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再利用ChemBio3D Ultra 14.0將其轉(zhuǎn)變?yōu)?D形式并優(yōu)化其結(jié)構(gòu)。使用AutoDock Tools(ADT，v.1.5.6)對(duì)配體和新建模型進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷、賦予原子類型等預(yù)處理并保存為PDBQT格式備用。以α-葡萄糖苷酶同源模型的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置配體對(duì)接空腔區(qū)域，在默認(rèn)參數(shù)中，采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行對(duì)接計(jì)算，每個(gè)配體進(jìn)行100個(gè)實(shí)驗(yàn)。在分子對(duì)接的結(jié)果中，對(duì)接能量最低的構(gòu)象最有可能是此研究預(yù)測(cè)結(jié)合模式，并使用PYMOL(DeLano Scientific LLC公司)和Discovery Studio 4.5(DS，北京迅利創(chuàng)成科技有限公司)進(jìn)行作圖示意。酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明黃柏堿為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，因此首先應(yīng)將PNPG與α-葡糖苷酶同源模型進(jìn)行分子對(duì)接并將兩者保存為PNPG-α-葡糖苷酶復(fù)合物文件，再將黃柏堿與該復(fù)合物進(jìn)行分子對(duì)接分析。

3 結(jié)果

3.1 黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

由表1可見(jiàn)，黃柏堿和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制都呈劑量依賴關(guān)系，隨著劑量的加大，抑制率增大。當(dāng)黃柏堿濃度為200 mg/L時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到64.46%。黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為126.36 mg/L，表明黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，但抑制作用弱于阿卡波糖。

表1 黃柏堿和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3.2 黃柏堿的酶抑制作用類型

3.2.1 可逆或不可逆抑制作用 由圖1動(dòng)力學(xué)曲線可以看出，不同濃度抑制劑的曲線交于一點(diǎn)，并且隨著反應(yīng)體系中黃柏堿濃度的增大，反應(yīng)速率降低，但未影響反應(yīng)的發(fā)生，表明黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制屬于可逆性抑制類型。

3.3 分子對(duì)接

3.3.1 同源建模及合理化評(píng)估 將α-葡萄糖苷酶MAL12的氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL服務(wù)器匹配獲得了50個(gè)模板，其中MAL12與3AXH序列殘基相似性高達(dá)72.51%，滿足同源模建同源性的要求,可將3AXH作為模板對(duì)MAL12進(jìn)行同源建模。將3AXH和MAL12的序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)進(jìn)行同源建模，結(jié)果顯示兩者比對(duì)的GMQE和QMEAN分別為0.92和-0.04，提示建立的蛋白模型質(zhì)量水平高。見(jiàn)圖3。

表2 黃柏堿在α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)中的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

通過(guò)Verify-3D程序檢測(cè)氨基酸殘基與序列中其他氨基酸的位置是否兼容來(lái)判定三維結(jié)構(gòu)的合理性；模型中95.16%殘基得分大于0.2，說(shuō)明建模結(jié)果較為合理(圖4)。結(jié)合PROCHECK程序生成的Ramachandran plot進(jìn)行評(píng)估，以主鏈的構(gòu)型中ψ和φ二面角的分布情形檢測(cè)模型的質(zhì)量，結(jié)果顯示共有99.4%的模型殘基位于最佳區(qū)域和允許區(qū)域中(圖5)，提示模建結(jié)構(gòu)氨基酸的二面角是非常合理的?？梢?jiàn)以3AXH為模板構(gòu)建出來(lái)的模型是可靠的,該結(jié)果與以往研究結(jié)果基本一致[15]，因此，建立的模型可用于后續(xù)的分子對(duì)接分析。

3.3.2 配體和受體的分子模擬對(duì)接 利用ADT、DS、PYMOL等軟件對(duì)配體和受體進(jìn)行預(yù)處理和結(jié)構(gòu)構(gòu)建，結(jié)果如圖6。根據(jù)文獻(xiàn)研究可知[16]，該構(gòu)建的α-葡萄糖苷酶同源模型存在5個(gè)活性位點(diǎn)，其中位點(diǎn)1(紅色)為競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)，其余4個(gè)皆定義為反競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)：位點(diǎn)2(綠色)、位點(diǎn)3(黃色)、位點(diǎn)4(灰色)、位點(diǎn)5(藍(lán)色)。

將PNPG、阿卡波糖、黃柏堿分別與α-葡萄糖苷酶的位點(diǎn)1進(jìn)行對(duì)接，三者與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能分別為-32.2、-37.3、-28.0 kJ/mol，提示PNPG與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合強(qiáng)于黃柏堿，而弱于阿卡波糖，說(shuō)明阿卡波糖能與底物PNPG競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)，而黃柏堿則難以與底物PNPG競(jìng)奪結(jié)合空間，這可能是黃柏堿作為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的主要原因。將黃柏堿分別與α-葡萄糖苷酶-PNPG復(fù)合物的位點(diǎn)2～5進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，黃柏堿與酶-底物復(fù)合物的2～5位點(diǎn)都有不同程度的親和，其中與位點(diǎn)5的結(jié)合能最低且其最好的對(duì)接構(gòu)象結(jié)合能為-31.4 kJ/mol，說(shuō)明相比其他位點(diǎn)，黃柏堿與酶-底物復(fù)合物位點(diǎn)5的結(jié)合最為穩(wěn)定，提示黃柏堿最有可能與位點(diǎn)5結(jié)合而起到反競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。見(jiàn)表3。如圖7所示,黃柏堿具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可能與其與LYS15、SER295、HIS258等氨基酸殘基形成氫鍵，與ALA289形成疏水相互作用以及與GLU10形成π-陰離子相互作用等有關(guān)。

表3 分子對(duì)接的結(jié)合能結(jié)果(kJ·mol-1)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立酶-抑制劑模型研究黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響，結(jié)果顯示黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，且隨著黃柏堿質(zhì)量濃度的升高，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。進(jìn)一步的酶抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明黃柏堿的抑制作用屬于可逆性的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，這與阿卡波糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用形式不同[17]。而分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了黃柏堿和阿卡波糖不同的抑制作用形式，阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)1的結(jié)合能最低，其次是底物PNPG，提示阿卡波糖比底物PNPG更易與位點(diǎn)1結(jié)合。當(dāng)向α-葡萄糖苷酶-PNPG體系中加入阿卡波糖時(shí)，阿卡波糖將與PNPG競(jìng)爭(zhēng)α-葡萄糖苷酶位點(diǎn)1的結(jié)合從而表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；而黃柏堿與位點(diǎn)1的結(jié)合弱于PNPG，當(dāng)向α-葡萄糖苷酶-PNPG體系中加入黃柏堿時(shí)，黃柏堿無(wú)法與PNPG競(jìng)爭(zhēng)α-葡萄糖苷酶位點(diǎn)1的結(jié)合，更易與反競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)結(jié)合而表現(xiàn)為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，黃柏堿體外對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為0.126 mg/mL，表明黃柏堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。小檗堿是黃柏生物堿中的主要成分[18]，有研究[19]考察了高純度的小檗堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果顯示小檗堿的IC50為2.02 mg/mL。小檗堿具有明確的降糖作用，從IC50的結(jié)果來(lái)看，黃柏堿明顯低于小檗堿，提示黃柏堿可能有較好的降糖作用，可能成為黃柏降血糖作用的相關(guān)活性物質(zhì)。

由于釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的三維晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，故本研究采用同源模建的方法建立了釀酒酵母來(lái)源的α-葡萄糖苷酶的3D模型。經(jīng)多指標(biāo)的綜合質(zhì)量評(píng)估分析可知，建立的模型具有一定的可靠性；利用模型蛋白分析了黃柏堿與α-葡萄糖苷酶相互作用的潛在機(jī)制，結(jié)果表明黃柏堿主要可能是通過(guò)與α-葡萄糖苷酶形成氫鍵、疏水作用和π-陰離子相互作用而發(fā)揮抑制作用。本研究為黃柏堿的降糖作用研究提供一定的參考和依據(jù)，同時(shí)還可為以黃柏堿為基礎(chǔ)，通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，開(kāi)發(fā)更加強(qiáng)效的黃柏堿衍生物的研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。