夏玲，郭盛，錢大瑋，武文星，卜凡淑，朱悅，趙明，牛陽，段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認知功能障礙為主的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，約占老年癡呆癥病例的80%[1]?！?019年世界老年癡呆癥報告》顯示，全世界約有5 000萬人患有老年癡呆癥，隨著人口老齡化，預計到2050年老年癡呆癥的發(fā)病率將增加2倍，給家庭及社會帶來沉重負擔[2]。AD發(fā)病機制復雜，涉及神經(jīng)元損傷和凋亡、神經(jīng)炎癥、突觸受損、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)不足、β淀粉樣蛋白(Aβ)和tau蛋白清除障礙并沉積等[3]。目前臨床常以吡拉西坦、多奈哌齊、美金剛等藥物治療AD，可一定程度上緩解或改善AD的臨床癥狀，但存在治療效果不理想、副作用大等問題[4]。經(jīng)過長期臨床實踐的中藥復方，因副作用小，且具有多成分、多作用靶點的特點，成為近年來AD防治藥物開發(fā)的熱點。

八珍益智方由龍眼肉、蓮子肉、茯苓、山藥、白術、益智仁、陳皮、炙甘草8味中藥組成，該方重用龍眼肉為君藥，開胃健脾，補虛益智；茯苓健脾安神，利竅去濕，開心益智，導濁生津，蓮子肉既能補脾養(yǎng)心，又可益腎固精，均為臣藥；佐以山藥既補脾氣，又益脾陰，補腎填精，可增強龍眼肉補益心脾之力[5]。全方具有增強智力、延緩衰老的作用。研究表明，八珍益智方中主要成分具有改善學習記憶能力和保護神經(jīng)作用[6-10]。但是，八珍益智方防治AD的藥效物質(zhì)基礎與作用機制并不明確。本文以八珍益智方中活性成分為研究對象，應用網(wǎng)絡藥理學[11]的研究方法，挖掘八珍益智方的主要活性成分和靶點，建立中藥-活性成分-靶點-疾病之間的關系，探究八珍益智方防治AD的物質(zhì)基礎和作用機制，為八珍益智方的進一步開發(fā)利用提供支撐。

1 方法

1.1 八珍益智方活性化學成分收集與整理

本研究基于TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“茯苓”“山藥”“白術”“益智仁”“陳皮”“甘草”為關鍵詞，收集八珍益智方中的化學成分，將收集到的化學成分以口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的龍眼肉和蓮子肉，利用BATMAN-TCM、TCMID、中國知網(wǎng)(CNKI)和Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索其化學成分。同時，為了盡可能全面獲得八珍益智方中主要活性成分的信息，本研究還結(jié)合國內(nèi)外文獻挖掘和整理，增加了文獻報道的八珍益智方組方藥材中具有抗AD的活性成分、入血成分以及中藥中含量較高的活性成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集化學成分結(jié)構(gòu)信息以及對所有成分的名稱進行整理。借助TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢所有潛在活性成分的靶標蛋白，利用Perl腳本，將所有篩選得到的靶點蛋白映射到Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，將查詢得到的所有蛋白名稱校正為官方名稱。

1.2 疾病靶點的確定

基于GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer disease”為關鍵詞檢索與疾病相關的作用靶點，并將檢索得到的疾病靶點合并去重。

1.3 中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

將篩選得到的活性成分、靶標基因、藥物等信息輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡，運用“Network analyzer”功能分析其拓撲學屬性，導出介度值、中心度值、度值等參數(shù)。

1.4 交集靶點的篩選

利用R語言3.6.3的VennDiagram數(shù)據(jù)包對八珍益智方主要化學成分作用靶點與AD疾病靶點數(shù)據(jù)集進行Venn分析，得到共同的靶點集，初步挖掘八珍益智方治療疾病的作用靶點。

1.5 PPI網(wǎng)絡圖構(gòu)建以及核心靶點的篩選

將Venn分析得到的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)，限定物種為Homo sapiens，設置Medium confidence>0.4，獲取蛋白間的相互作用信息，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖。將分析結(jié)果保存為tsv文件，通過Cytoscape 3.7.2軟件對其進行拓撲學分析，分析內(nèi)容包括度值、介度值、中心度值，其中，將大于節(jié)點平均數(shù)對應的數(shù)值節(jié)點定義為核心靶點。

1.6 基因本體(GO)和基因組百科全書(KEGG)功能富集分析

為說明方藥-疾病交集靶點在基因功能中的作用，通過DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO和KEGG功能富集分析，以P<0.05為選取標準，并利用R語言3.6.3對結(jié)果作可視化處理。

1.7 分子對接

分子對接是評價藥物活性成分與藥物靶點結(jié)合能力的方法。利用AutoDock Vina 1.1.2對八珍益智方中的核心化合物和度值排名前5的靶點進行分子對接試驗。利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載化合物sdf結(jié)構(gòu)文件，導入Chem 3D軟件調(diào)整化合物空間構(gòu)象，Minimize能量優(yōu)化，保存為mol2格式，經(jīng)AutoDockTools 1.5.6分配電荷、設置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為pdbqt格式文件。從PDB(https://www.rcsb.org/)下載靶蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID分別為4EKL、2ZOQ、4ZS7、5T89、1GFW，pbd格式)，利用PyMol將去除靶蛋白水分子，分離原始配體和受體，得到的靶蛋白導入AutoDockTools 1.5.6加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。利用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接，利用GraphPad Prism 8將化合物以及對應靶蛋白對接得到的結(jié)合能構(gòu)建熱圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物及靶點的篩選

用TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到226個化合物作用靶點，共篩選出200個符合條件的活性化合物，其中龍眼肉8個，蓮子肉11個，茯苓17個，山藥19個，白術15個，益智仁24個，陳皮12個，甘草94個，刪重后得到188個化合物。

2.2 疾病相關靶點及交集靶點的篩選

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer disease”為關鍵詞，將搜集到的靶點合并去重，得到阿爾茨海默病的相關靶點9 135個，通過R語言3.6.3的VennDiagram數(shù)據(jù)包得到188個“方藥-疾病”交集靶點。

2.3 中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡構(gòu)建和核心化合物分析

通過對方藥-疾病交集靶點反向推導得到作用于AD的化合物為148個，運用Cytoscape 3.7.2軟件將8味中藥、148個化學成分及188個方藥-疾病交集靶點進行關聯(lián)并構(gòu)建中藥-化合物-疾病靶點圖(圖1)。網(wǎng)絡中共包括344個節(jié)點(8種中藥節(jié)點，148種化合物節(jié)點，188種靶點節(jié)點)和1 582條邊。利用Cytoscape 3.7.2軟件的“Network analyze”功能，以網(wǎng)絡中節(jié)點介度值(均值為0.006 2)、中心度值(均值為0.329)、度值(均值為9.3)等參數(shù)大于均值為條件篩選得15個關鍵成分，其中，槲皮素(度值為114)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(度值為26)、芒柄花素(度值為25)、美迪紫檀素(度值為22)、Shinpterocarpin(度值為22)、甘草查爾酮A(度值為22)、異鼠李素(度值為20)為甘草中的成分；山柰酚(度值為72)為甘草和益智仁的共有成分；柚皮苷(度值為45)為甘草和陳皮的共有成分；豆甾醇(度值為33)為益智仁、山藥、茯苓、蓮子的共有成分；川陳皮素(度值為18)為陳皮中的成分；荷葉堿(度值為13)、原荷葉堿(度值為13)為蓮子肉中的成分；表兒茶素(度值為12)為龍眼肉中的成分，β-谷甾醇(度值為16)為龍眼肉、山藥、益智仁、陳皮和甘草共有成分。詳見表1。

2.4 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心靶點的篩選

將188個交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫即可得到PPI圖，將組織(Organism)設置為“Homo sapiens”。文件以tsv格式保存，將188個交集靶點相互作用信息上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，以網(wǎng)絡中節(jié)點介度值(均值為0.005 2)、中心度值(均值為0.522)、度值(均值為37.74)等參數(shù)大于均值為條件篩選得核心靶點37個(見圖2～3)，這可能是八珍益智方治療阿爾茨海默病的關鍵靶點。其中AKT1、MAPK3、IL-6、VEGFA、CASP3為度值排名前5的節(jié)點。

表1 中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡關鍵節(jié)點

2.5 GO功能富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析得到1 331個條目(P<0.05)，包含1 120個生物過程(BP)條目(圖4)，81個細胞組成(CC)條目(圖5)，130個分子功能(MF)條目(圖6)。在生物過程中靶點主要涉及細胞增殖調(diào)節(jié)(Regulation of cell proliferation)、對有機物質(zhì)的反應(Response to organic substance)、對內(nèi)源性刺激的反應(Response to endogenous stimulus)等；在細胞組成中靶點主要涉及細胞分數(shù)(Cell fraction)、細胞外間隙(Extracellular space)、不溶部分(Insoluble fraction)等；在分子功能中靶點主要涉及胺結(jié)合(Amine binding)、藥物結(jié)合(Drug binding)、胺受體活性(Amine receptor activity)等。

2.6 KEGG富集分析

通過使用DAVID數(shù)據(jù)庫，得到65條KEGG信號通路(P<0.05)，根據(jù)基因靶點在通路富集的數(shù)目(圖7)，主要涉及癌癥的途徑(Pathways in cancer)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、前列腺癌(Prostate cancer)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)等，提示上述通路與八珍益智方干預AD的發(fā)生發(fā)展密切相關。

2.7 分子對接結(jié)果

一般認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。參考文獻以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol(約為-1.2 kcal/mol)作為篩選標準[12]，將“2.3”項中篩出的15個核心化合物以及“2.4”項中度值排名前5的核心靶點進行分子對接。結(jié)果顯示核心化合物與AKT1、MAPK3、IL-6、VEGFA、CASP3結(jié)合能均遠小于-5.0 kJ/mol，提示化合物與靶蛋白的結(jié)合活性較高。熱圖分析發(fā)現(xiàn)，與AKT1(PDB ID：4EKL)對接結(jié)合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有5個，分別是槲皮素、豆甾醇、Shinpterocarpin、異鼠李素和荷葉堿；與MAPK3(PDB ID：2ZOQ)對接結(jié)合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有7個，分別是槲皮素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、芒柄花素、甘草查爾酮 A、Shinpterocarpin和美迪紫檀素；與IL-6(PDB ID：4ZS7)對接結(jié)合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有1個，為Shinpterocarpin；與VEGFA(PDB ID：5T89)對接結(jié)合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有2個，分別為Shinpterocarpin和美迪紫檀素；與CASP3(PDB ID：1GFW)對接結(jié)合能所有化合物均大于-33.472 kJ/mol。詳見圖8。

分子對接結(jié)果表明，通過網(wǎng)絡藥理學篩選得到的核心化合物和關鍵靶點都具有較好的結(jié)合活性。有研究表明，槲皮素、山柰酚、柚皮苷可以抑制AD模型動物或細胞的MAPK表達[13]，從實驗角度說明了篩選結(jié)果的可靠性。

3 討論

TCMSP是中藥網(wǎng)絡藥理學研究常用數(shù)據(jù)庫，但是，滿足OB≥30%及DL≥0.18特征的陳皮黃酮類成分(如陳皮素)在數(shù)據(jù)庫中未見收錄。改善認知為益智仁的傳統(tǒng)功效，但數(shù)據(jù)庫未收錄益智仁中具有神經(jīng)保護作用的黃酮類、二苯庚烷類、倍半萜類成分[14]以及具有改善學習記憶的揮發(fā)油成分[15-16]。此外，白術藥材中含有的白術內(nèi)酯Ⅰ、白術酮、雙白術內(nèi)酯等雖不滿足篩選條件，但已有文獻報道其具有抗AD作用[17]。本文在TCMSP數(shù)據(jù)庫的基礎上，經(jīng)文獻查閱及數(shù)據(jù)挖掘，增加了8味藥材中具有抗AD作用以及可以入血的成分，對TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果進行了補充，為下一步的靶點預測以及通路篩選奠定基礎。

從八珍益智方中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡分析中可以推測，槲皮素、山柰酚、柚皮苷等化學成分是與AD相關靶點作用最多的化學成分，提示其可能與八珍益智方治療AD密切相關。據(jù)報道，槲皮素可以通過血腦屏障，對乙酰膽堿酯酶具有抑制作用[18]，且可通過誘導神經(jīng)保護[19]和預防tau蛋白病變[20]減輕AD的癥狀。山柰酚可劑量依賴性保護大鼠腦I/R組織梗死體積，改善神經(jīng)功能損傷，抑制小膠質(zhì)細胞的激活，調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，減少炎癥蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)炎癥以及保護血腦屏障功能[21]。柚皮苷可通過降低海馬核因子-κB(NF-κB)、Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、環(huán)氧合酶2(COX2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)水平及其免疫反應性，從而減輕脂多糖引起的認知功能障礙和神經(jīng)炎癥[22],推測上述物質(zhì)可能是八珍益智方抗AD的潛在藥效物質(zhì)。

KEGG代謝通路結(jié)果顯示，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路富集了24個靶點，提示該通路可能與八珍益智方治療AD有關。MAPK是一組細胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在哺乳動物中主要由細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、氨基末端激酶(JNK)和p38蛋白激酶(p38 MAPK)三條信號轉(zhuǎn)導途徑組成，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等，與學習記憶能力有密切聯(lián)系。MAPK通路與AD的病理機制密切相關，可以抑制Aβ誘導的神經(jīng)元損傷、改善靶向Tau病理學、減輕神經(jīng)炎癥和提高突觸可塑性等[23]。文獻報道白術內(nèi)酯Ⅰ和白術內(nèi)酯Ⅲ可以通過MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用，從炎癥通路發(fā)揮抗AD的作用[24]。上述研究結(jié)果在一定程度上為本研究提供了實驗依據(jù)，為開展相關驗證研究奠定了理論基礎。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法分析了八珍益智方防治AD的潛在化學組分及調(diào)控分子機制，通過篩選得到148個潛在活性成分和188個潛在作用靶點，有65條代謝通路可能與AD有關，涉及MAPK信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路等，揭示八珍益智方可通過減輕炎癥反應、增強膽堿能功能、調(diào)節(jié)tau蛋白、調(diào)控鈣平衡等多種途徑來發(fā)揮治療AD的效果，表現(xiàn)出多成分、多靶點、多通路的作用特點。本文通過結(jié)合文獻研究、網(wǎng)絡分析、分子對接，對八珍益智方的化學成分、作用靶點和相關疾病信號通路進行了探索性研究，為八珍益智方抗AD的后續(xù)實驗研究提供一定的理論基礎。