陳 月 蔡西栗 孫 雪 張小倩 徐年軍

(1. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 浙江省海洋生物工程重點實驗室,寧波 315211; 3. 浙江省平陽縣海洋與漁業(yè)局, 平陽 325400)

瓊膠是一種膠狀的半乳聚糖生物大分子, 是由D型半乳糖與3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖以β-1,3和α-1,4糖苷鍵重復(fù)交聯(lián)而成的中性多聚糖, 作為紅藻細胞壁的組成成分, 與陸地植物的半纖維素的生物功能相似, 但其更強的柔韌性給予了大型海藻抵抗強烈波浪和水流的能力[1]。在紅藻中瓊膠還具有抵抗病原菌侵擾, 保持細胞內(nèi)離子平衡, 提高海藻抵抗極端的鹽度、pH、溫度逆境等功能[2,3]。

瓊膠生物合成開始于高爾基體中的半乳糖糖基化, 隨后在轉(zhuǎn)移到細胞壁之前進行早期的硫酸化,關(guān)于半乳糖轉(zhuǎn)運體的研究還十分缺乏, 只知道它在高爾基體膜上, 之后瓊膠大分子中C-6位硫酸化的L型半乳糖單位會脫水形成3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖, 3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖含量的多少決定了瓊膠的凝膠性能,而半乳糖的硫化并非只發(fā)生在C-6位上, 在L-半乳糖的C-2和C-3位與D-半乳糖的C-2和C-4位也發(fā)現(xiàn)了硫化, 這些半乳糖硫化可能都需要特異的磺基轉(zhuǎn)移酶與硫酸化酶[3]。

龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是紅藻門(Rhodophyta)、江蘺科 (Gracilariaceae)、龍須菜屬(Gracilariopsis) 的大型產(chǎn)瓊膠海藻, 在中國沿海地區(qū)大面積養(yǎng)殖, 由于瓊膠市場需求量的上升, 中國龍須菜產(chǎn)量從2004年的8.88×107kg, 增加到了2017的30.86×107kg, 并且仍在不斷增加[4,5]。由于其生長速度快, 產(chǎn)量高, 瓊膠品質(zhì)好, 是生產(chǎn)瓊膠的主要原料[6]。龍須菜的瓊膠合成代謝通路一直都是研究的熱點, 克隆出龍須菜中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖磷酸變位酶基因, 并發(fā)現(xiàn)這些基因的表達對瓊膠含量有一定影響[7—9], α-葡萄糖苷酶可以催化降解紅藻淀粉生成葡萄糖, 也可能促進龍須菜瓊膠含量的積累[10]。

研究發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)膠紅藻在生長鹽度變化時瓊膠含量會出現(xiàn)上升, 推測其在抵抗細胞外部滲透壓變化的過程中會合成更多的瓊膠, 為細胞提供更強的支撐力, 其中合成瓊膠所用半乳糖前體的來源可能是紅藻糖苷和紅藻淀粉的降解, 而促進紅藻糖苷降解的正是α -半乳糖苷酶(GLA)[10—12]。與其他江蘺品種相比, 龍須菜對高溫的耐受性更強, 但對鹽度的耐受范圍更窄, 在鹽度25環(huán)境下生長狀態(tài)最好[13]。不同鹽度培養(yǎng)的龍須菜會出現(xiàn)瓊膠含量的顯著差異, 在低鹽條件下培養(yǎng)2周, 瓊膠含量顯著升高[8]。本實驗研究了不同鹽度下龍須菜的生長速率、暗呼吸與光合放氧速率、瓊膠含量和代表性糖類的相對含量以及瓊膠合成過程中g(shù)la、gat、gst和gas基因的表達量變化, 揭示了不同鹽度條件導(dǎo)致瓊膠含量變化的規(guī)律, 旨在發(fā)現(xiàn)鹽度逆境脅迫對龍須菜瓊膠合成的影響, 探究其在瓊膠合成通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料處理

實驗材料龍須菜為981品系, 采自福建霞浦海藻養(yǎng)殖場 (26°71′N, 119°99′E), 養(yǎng)殖海域內(nèi)海水鹽度接近25, 用消毒海水清洗, 刷除雜藻與泥沙, 截取健康側(cè)枝于實驗室恒溫光照培養(yǎng)箱中馴化培養(yǎng)1個月。實驗設(shè)置3個鹽度, 分別為15(低鹽)、25(正常海水鹽度)、35(高鹽), 培養(yǎng)溫度為23℃, 光強40 μmol/(m2·s), 光暗周期為12L﹕12D, Provasoli培養(yǎng)基每3—4d更換1次, 分別在第3和第15天取樣測定酶活和基因表達, 瓊膠含量與糖含量測定只在第15天取樣。

1.2 相對生長速率 (RGR) 的測定

通過測定龍須菜在培養(yǎng)周期內(nèi)的藻體鮮重變化, 計算龍須菜的相對生長速率(Relative growth rate,RGR), 測定時用吸水紙包裹藻體4000 r/min離心30s, 去除藻體表面水分后稱重。

式中,W0為實驗開始時藻體的鮮重(g),Wt為實驗結(jié)束時藻體的鮮重(g),t為實驗天數(shù)(d)。

1.3 暗呼吸和光合放氧速率的測定

采用液相氧電極 (Hansatech, 英國)測定龍須菜的暗呼吸與光合放氧速率, 先使用耗氧劑連二亞硫酸鈉對培養(yǎng)液氧含量曲線進行調(diào)零校準, 然后稱取0.01 g龍須菜放入2 mL的氧飽和新鮮培養(yǎng)液中, 嚴格控制溫度在23℃, 遮罩避光測定暗呼吸速率, 然后在培養(yǎng)光強下測定光合放氧速率。

1.4 α -半乳糖苷酶酶活性的測定

α -半乳糖苷酶(GLA)活力的測定參照Ekman等的方法并加以修改[12], 利用GLA能將對硝基酚-α-吡喃半乳糖降解成對硝基酚的特性, 通過在405 nm比色測定對硝基苯酚的生成量, 可以計算反應(yīng)液中GLA的活力。

1.5 瓊膠的提取與含量測定

龍須菜中瓊膠的提取方法參照薛志欣等[14], 具體操作略有改動。先取一定量的藻體, 用清水沖洗干凈藻體表面的鹽分后在65℃烘干至恒重, 稱量干重, 并按每100 mg干重藻體加入4 mL 4% NaOH溶液, 在85℃ 水浴中處理2h, 用2層300目篩絹網(wǎng)過濾并洗滌藻體至中性, 然后每100 mg干重藻體添加6 mL蒸餾水, 于120—125℃的高壓鍋中加熱煮沸提取瓊膠2h。用8層300目篩絹網(wǎng)擠壓過濾并收集濾液, 待濾液在室溫下冷卻并凝固后放入–20℃冷凍過夜, 常溫解凍后用蒸餾水浸泡沖洗去除雜質(zhì), 最后冷凍干燥獲得瓊膠干重。計算瓊膠含量(%)。

1.6 目的基因的克隆及定量

目的基因片段的獲得根據(jù)龍須菜基因組組裝結(jié)果[15]設(shè)計引物(表 1), PCR擴增得到編碼993個氨基酸的gla基因(MF988355)、編碼706個氨基酸的gat基因(MF988358)、編碼352個氨基酸的gst基因 (MF988360) 及編碼627個氨基酸的gas基因(MF988361.1)。

總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄稱取新鮮龍須菜藻體100 mg, 按照OMEGA公司的Plant RNA Kit 試劑盒說明書方法提取總RNA, 經(jīng)過電泳檢測, Nanodrop 測定純度和濃度后, 使用 TaKaRa去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到各個樣本相同濃度的 cDNA模板, –20℃冷凍保存。

目的基因的相對定量與表達分析根據(jù)目的基因的序列信息使用primer5.0設(shè)計定量專用的特異引物, 首先進行預(yù)實驗對引物的熔解曲線進行分析, 確定引物的特異性, 選用β-actin基因作為內(nèi)參進行上樣誤差校正和標準化, 內(nèi)參定量PCR引物參考朱招波等[16]并進行驗證。使用Eppendorf 實時熒光定量PCR儀, 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR, 反應(yīng)采用 20 μL體系: SYBR Green I Master (Roche) 10 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各 0. 4 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 7.2 μL。每組處理進行兩次完全獨立實驗, 每個獨立實驗進行三次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后進行Ct值分析, 采用2–ΔΔCt法確定各目的基因的mRNA相對含量[17]。

表 1 所用引物及其用途Tab. 1 The primers and purpose

1.7 單糖含量的GC-MS分析

將龍須菜干樣品研磨成粉后取20 mg, 加入700 μL的甲醇渦旋渾勻15s, 14000 r/min離心10min后取上清500 μL, 加入300 μL三氯甲烷混勻, 待溶液完全混勻后再加入750 μL的純水, 混勻15s后14000 r/min離心10min, 取100 μL上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中抽干水分。加入40 μL的甲氧基胺鹽酸鹽(20 mg/mL吡啶溶解), 在37oC下震蕩反應(yīng)2h, 然后混勻并短暫離心, 加入70 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA), 在37oC下震蕩反應(yīng)30min, 混勻并短暫離心后轉(zhuǎn)移100 μL至樣品瓶待測[18]。

使用1300/ITQ 900 GC-MS系統(tǒng) (Thermo Fisher Scientific, USA) 進行檢測分析。GC-MS條件如下:Restek TR-5ms (30 m×0.25 mm×0.25 mm) 色譜柱,進樣口溫度為 250℃, EI離子源230℃, 使用高純氦氣作為載氣, 進樣量1 μL, 不分流進樣。初始溫度60℃, 2min后以10℃/min的速度升高到150℃, 保留10min后繼續(xù)以15℃/min的升溫速度達到250℃, 質(zhì)譜m/z范圍在50—550。通過National Institute of Standards and Technology(NIST) 和MassBank website(http://www.massbank.jp) 的質(zhì)荷比及相對豐度比對化合物進行鑒定分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析,用one-way ANOVA(Tukey) 進行差異顯著性檢驗,設(shè)顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽度處理下龍須菜的生長速率及光合特性變化

鹽度25時龍須菜的生長速度最快, 高鹽和低鹽條件下的龍須菜生長速率都有不同程度的降低(圖 1)。在高鹽條件下龍須菜生長受到了顯著的抑制, 與正常鹽度相比, 相對生長速率降低了50.21%(P<0.05);在低鹽條件下龍須菜的生長也受到了一定的抑制,相對生長速率降低了12.53%。

在鹽度25的培養(yǎng)條件下, 龍須菜暗呼吸和光合放氧速率較為平穩(wěn), 生長的第3和第15天沒有明顯變化(圖 2), 呼吸速率約為13 μmol O2/(h·g), 光合放氧速率約為18 μmol O2/(h·g)。與鹽度25相比, 低鹽和高鹽下生長3d后, 呼吸速率顯著升高(P<0.05), 在低鹽下升高了82.57%, 在高鹽下升高了53.40%, 在生長到達第15天時, 在低鹽下的呼吸速率與正常鹽度沒有顯著差異(P>0.05), 而在高鹽下的龍須菜呼吸速率仍然比正常鹽度要高18.20%(P<0.05)。龍須菜光合放氧速率在低鹽和高鹽條件下3d后與正常鹽度龍須菜相比顯著降低 (P<0.05), 分別降低了49.62%和24.84%, 經(jīng)過15d的適應(yīng)之后, 在低鹽和高鹽下龍須菜的光合放氧速率恢復(fù)到與正常鹽度沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖 1 不同鹽度處理下龍須菜的相對生長速率Fig. 1 The relative growth rate (RGR) of G. lemaneiformis in different salinities

圖 2 在不同鹽度處理下龍須菜生長3d及15d后的暗呼吸速率(A)和光合放氧速率(B)Fig. 2 Dark respiration rate (A) and photosynthetic oxygen evolution rate (B) of G. lemaneiformis in different salinities after 3d and 15d

2.2 不同鹽度條件對龍須菜瓊膠含量的影響

在培養(yǎng)15d后, 鹽度15、25和35條件龍須菜瓊膠含量分別為9.27%、6.91%和8.09%(圖 3), 在低鹽和高鹽條件下龍須菜的瓊膠含量都顯著高于鹽度25條件下的瓊膠含量(P<0.05), 在不同鹽度下龍須菜瓊膠含量鹽度15>鹽度35>鹽度25。

2.3 不同鹽度對龍須菜基因表達的影響

圖 4顯示, 在處理第3和第15天時, 在低鹽和高鹽條件下龍須菜中的gla基因表達均高于正常鹽度,在第3天, 分別達到正常鹽度的1.58倍(P<0.05)和1.16倍(P>0.05), 在第15天時分別為正常鹽度的1.34倍(P<0.05)和1.63倍(P>0.05)。在低鹽條件下gat基因的表達在短期內(nèi)受到了一定的抑制, 相對正常鹽度降低了48%, 在高鹽條件下為正常鹽度1.53倍; 在第15天時在低鹽下表達量回升到正常鹽度的1.38倍, 在高鹽下表達量升高到正常鹽度的3.03倍, 都表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。

圖 3 龍須菜在不同鹽度下培養(yǎng)15天后的瓊膠含量Fig. 3 The agar content of G. lemaneiformis in different salinities after 15 days

圖 4 不同鹽度對龍須菜gla(A)和gat(B)基因表達的影響Fig. 4 Effects of different salinity on gla (A) and gat (B) gene expression of G. lemaneiformis

相對于鹽度25, 在低鹽條件下龍須菜gas基因的相對表達量在處理的第3天顯著下降了52.59%(P<0.05), 高鹽下無顯著差異; 第15天時3個鹽度下的表達量無顯著差異(圖 5)。在處理第3天時, 在高鹽和低鹽條件下龍須菜gst基因的表達量相對鹽度25分別顯著下降50%和45%(P<0.05), 在高鹽和低鹽條件下的表達量無顯著差異(P>0.05), 在第15天時都與鹽度25無顯著差異(P>0.05)。

圖 5 不同鹽度對龍須菜gas(A)和gst(B)基因表達的影響Fig. 5 Effects of different salinity on gas (A) and gst (B) gene expression of G. lemaneiformis

2.4 不同鹽度對龍須菜GLA酶活性的影響

在處理第3天時, 在不同鹽度條件下龍須菜中的GLA酶活發(fā)生顯著變化(圖 6), 在低鹽和高鹽條件下酶活分別達到正常鹽度的1.63倍和2.53倍(P<0.05), 不同鹽度之間差異顯著(P<0.05), 當培養(yǎng)15d時在不同鹽度下龍須菜的GLA酶活性已無明顯差異。

2.5 不同鹽度下龍須菜中代表性糖類的相對含量變化

龍須菜在3種不同鹽度下生長15d后, 使用MSTFA對樣品進行糖的衍生化處理, 對其進行GCMS分析, 檢測到的代謝產(chǎn)物主要有核糖醇、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和海藻糖等(圖 7)。

圖 6 不同鹽度對龍須菜GLA酶活性的影響Fig. 6 The activities of GLA of G. lemaneiformis under different salinity

圖 7 不同鹽度處理15天后龍須菜中糖類相對含量變化Fig. 7 Changes of sugar content of G. lemaneiformis after 15d of different salinity treatments

在高鹽條件下半乳糖和海藻糖的含量顯著升高, 分別為鹽度25的3.27倍和6.00倍, 其他糖類與正常鹽度無顯著差異。

3 討論

鹽度是影響海洋藻類生長繁殖的重要環(huán)境因子, 具有明顯的地理與季節(jié)性變化。鹽度對各種紅藻瓊膠的產(chǎn)量和質(zhì)量的影響有較大差異, 研究表明紅藻在鹽度變化時, 生長速度下降, 光合作用、碳固定及氮磷的吸收受到抑制, 同時會消耗更多的能量來維持細胞的離子平衡, 從而導(dǎo)致瓊膠含量的下降[19—21]。也有研究證明紅藻在環(huán)境鹽度變化時, 因為要抵抗外部滲透壓的變化, 細胞需要補充和修飾細胞壁間的瓊膠, 從而為細胞提供更強的支撐力,引起瓊膠含量的上升, 其中瓊膠前體的來源可能是紅藻糖苷與紅藻淀粉的降解[10—12]。

3.1 鹽度對龍須菜生長、形態(tài)結(jié)構(gòu)和呼吸的影響

在鹽度25條件下龍須菜的生長速度最快, 其次為鹽度15, 鹽度35最慢。在不同鹽度下龍須菜在15d后形態(tài)特征也有了一定的區(qū)別, 在低鹽條件下側(cè)枝分化較少, 在高鹽條件下生長受到明顯抑制,枝干最短。在鹽度15條件下的龍須菜細胞色素體板層結(jié)構(gòu)明顯腫脹且細胞間孔狀聯(lián)系部分被破壞,胞內(nèi)紅藻淀粉顆粒變少; 在鹽度35條件下的藻體細胞內(nèi)出現(xiàn)大量白色鹽粒, 色素體板層結(jié)構(gòu)模糊腫脹且細胞間孔狀聯(lián)系扭曲變形[22]。低鹽與高鹽處理后的龍須菜在短期內(nèi)暗呼吸速率都顯著升高且光合放氧速率下降, 但是在經(jīng)過半個月的適應(yīng)之后,鹽度對光合及呼吸的影響明顯降低。

3.2 龍須菜瓊膠合成單體和前體聚合通路的酶

瓊膠的合成可以分為瓊膠單體的生物合成和瓊膠前體形成聚合兩部分, 其中關(guān)于瓊膠單體的合成研究比較多, 迄今為止已經(jīng)找到了一些與瓊膠單體合成有關(guān)的酶, 如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶、GDP-甘露糖-3′,5′-表異構(gòu)酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶等, 逐漸完善出了瓊膠單體合成的通路[7,23,24], 但目前瓊膠單體的聚合及其半乳糖骨架上各種取代基支鏈的形成還不夠了解。半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和丙酮酰轉(zhuǎn)移酶作為瓊膠合成第二階段的關(guān)鍵酶類, 它們的變化與瓊膠的含量及質(zhì)量都具有相關(guān)性。

3.3 鹽度對龍須菜瓊膠合成相關(guān)酶和基因表達的影響

GLA可以催化降解紅藻糖苷來生成瓊膠合成前體UDP -D-半乳糖[25], 研究對龍須菜在3種不同鹽度下gla、gat、gst和gas基因的表達進行了分析, 在高鹽條件下龍須菜中GLA酶活和基因表達量都最高, 半乳糖的含量也顯著高于其他兩組, 但是酶活和基因相對表達量的變化與瓊膠含量并不呈現(xiàn)完全的線性相關(guān), 說明雖然細胞中紅藻糖苷降解生成了半乳糖, 但是產(chǎn)生的半乳糖并沒有被充分利用,反而隨之積累而含量升高, 并通過反饋調(diào)節(jié)使gat基因過量表達。在低鹽條件下龍須菜中GLA酶活升高, 但半乳糖的含量卻明顯降低, 說明發(fā)生了活躍的半乳糖轉(zhuǎn)化, 紅藻糖苷降解生成的半乳糖進入了合成瓊膠的通路。在低鹽條件下紅藻淀粉也會降解生成葡萄糖, 但實驗顯示葡萄糖含量也顯著下降。Hu等[26]發(fā)現(xiàn)在低鹽條件下培養(yǎng)2周后龍須菜中不僅淀粉含量下降, 其淀粉合成酶的基因表達也會受到抑制, 說明在低鹽條件下龍須菜會消耗其他的多糖來合成更多的瓊膠來保護自己, 同時也發(fā)現(xiàn)合成GDP-L-半乳糖的通路會受到抑制, 表明此時UDP-D-半乳糖的升高才是瓊膠含量增長的原因,增長的瓊膠幾乎都源自紅藻淀粉與紅藻糖苷的轉(zhuǎn)化而不是由卡爾文循環(huán)提供原料。

GST是將糖脂硫化的關(guān)鍵酶, 在細胞膜上起到抗菌抗氧化的作用, 這也是藻類細胞中半乳糖和硫酸基重要流向之一。實驗中發(fā)現(xiàn)它在逆境鹽度下表達受到抑制, 顯示流向細胞膜合成的半乳糖與硫酸基的減少[27]。藻類中多糖需要在高爾基體中硫化之后才能轉(zhuǎn)運到胞外生成瓊膠[3]。我們發(fā)現(xiàn)在低鹽條件下gas基因的相對表達量會下降, 這可能導(dǎo)致了6-硫酸根-L-半乳糖的生成量減少, 進入細胞壁間的C-3和C-4位硫酸化的半乳糖相對含量升高后,正常生成瓊膠所需的3,6 -內(nèi)醚-L-半乳糖含量減少,而硫酸酯基取代基含量上升, 長期過程中導(dǎo)致瓊脂膠的含量上升而瓊脂糖的含量下降, 凝膠強度下降但含量上升。單純減少硫元素的輸入在短時間內(nèi)會讓龍須菜中瓊膠含量和凝膠強度都有輕微的上升, 長時間內(nèi)又會引起瓊膠含量的下降[28], 很有可能就與GAS的作用有關(guān)。影響龍須菜瓊膠含量的因素復(fù)雜多樣, 這些因素往往還會對瓊膠的凝膠質(zhì)量產(chǎn)生影響, 想要分別完全揭示這些因素的作用模式是比較困難的[29]。

本結(jié)果表明, 在低鹽條件下, 龍須菜中紅藻淀粉和紅藻糖苷降解后生成的單糖大量的進入到瓊膠合成的途徑中, 在GAS的作用下, 瓊膠中的硫酸酯基含量上升, 導(dǎo)致了凝膠強度下降但瓊膠含量上升。在高鹽條件下, 雖然也有紅藻淀粉和紅藻糖苷降解, 但降解后形成的單糖沒有去合成瓊膠, 推測在高鹽條件下瓊膠合成通路中有關(guān)鍵酶活性被抑制, 引起了半乳糖的積累及其向海藻糖的轉(zhuǎn)化。