張學東 盧建華 王夢寒 戴二黑★

自從1965年美國巴魯克·布倫博格博士（Baruch Blumberg）發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原即乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）以來，至今已有50 多年的歷史［1］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的實驗室檢測方法不斷涌現(xiàn)和更新?lián)Q代，HBV DNA、HBV RNA、HBV cccDNA 定量檢測、HBV 基因型與基因突變位點檢測、HBV 核心相關抗原（HBcrAg）檢測等新技術、新方法相繼問世并在臨床逐漸推廣應用［2-6］。與此同時，傳統(tǒng)的HBV 血清學標志物如常用的HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 乙肝“兩對半”等檢測技術也不斷創(chuàng)新發(fā)展［7］，從最初的免疫擴散技術相繼建立了對流免疫電泳技術（CIEP）、紅細胞凝集試驗、放射免疫分析試驗（Rodio Immunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）、固相膜免疫分析技術、化學發(fā)光免疫分析技術（chemiluminescent immunoassay，CLIA）等。

本文重點對以上HBV 血清學標志物檢測技術的原理及其特點進行簡要介紹，旨在幫助大家在正確地了解HBV 血清學標志物檢測方法的基礎上，根據(jù)各單位的實際情況科學合理的選用這些技術。

1 HBV 血清學標志物檢測技術

1.1 對流免疫電泳技術

對流免疫電泳是將雙向免疫擴散與電泳相結合，在直流電場中定向加速的免疫擴散技術。1970年，Gocke、prinee 等用對流免疫電泳技術檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和表面抗體（HBsAb），取得了較好的效果而被推廣應用［8］；中國學者余乾炎和張志榮也在HBsAg 上做了相應研究［9］。該試驗相對簡單、快速，靈敏度相比雙向免疫擴散試驗提高8～16 倍，可測定的蛋白質濃度最低限度達μg/mL 水平。該方法常用于抗原或抗體的性質、效價和純度的測定，但不適用于抗原為免疫球蛋白或抗原抗體遷移率接近的情況，否則會導致抗原抗體朝同一個方向泳動［9］。目前隨著新的檢測技術的發(fā)展，乙肝血清學標志物檢測目前很少應用此技術。

1.2 紅細胞凝集試驗

紅細胞凝集試驗利用抗人O 型紅細胞的單克隆抗體，該抗體能與任何血型的紅細胞結合而不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，將此抗體與特異性抗體或抗原連接，運用特異性凝集反應可檢測標本中的抗原或抗體［10］。該試驗中受檢標本為新鮮全血，取手指血或耳垂血即可進行實驗，受檢者即刻可知檢測結果。此試驗以前曾經(jīng)用于檢測乙肝表面抗原，靈敏度為2～5 IU/mL，根據(jù)最新國家行業(yè)標準要求［11］，HBsAg要求檢測限adr≤0.1 IU/mL，adw≤0.1 IU/mL，ay≤0.2 IU/mL，因此此技術靈敏度不能滿足國家標準要求，乙肝血清學標志物檢測一般不再使用此技術。

1.3 放射免疫分析試驗

放射性免疫試驗以放射性核素為基本特征，用放射性核素標記抗原或抗體分子，通過測定放射性強度評估抗原-抗體反應的情況，從而實現(xiàn)對待測物質的定量或定性分析［12］。放射免疫試驗將放射性核素的高靈敏性與抗原-抗體間的高特異性結合于一體，檢測HBsAg 靈敏度可以達到0.5 IU/mL。放射性免疫試驗開創(chuàng)了體液微量物質定量分析的新紀元［13］，并為建立酶免疫試驗、化學發(fā)光免疫試驗等方法奠定了理論和實踐基礎。目前，由于放射性核素的放射性污染問題，放射免疫試驗已經(jīng)逐漸被酶免疫試驗、化學發(fā)光免疫試驗等方法所替代。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗是以酶作為標記指示物，以抗原抗體免疫反應為基礎的固相吸附測定方法。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性［14］。ELISA 技術因具有方法簡單、易于操作、試劑開放、成本較低等優(yōu)點，從上世紀80年代開始一直占據(jù)臨床免疫學檢測領域的主導地位，采用此技術檢測乙肝血清學標志物乙肝“兩對半”，如HBsAg 靈敏度可以達到0.1 IU/mL［15］。但是，因為存在手工操作誤差大、耗費人力，結果報告時間久，灰區(qū)結果較多，難以準確定量，需要批量操作，以及靈敏度和特異性較低等劣勢，人們一直在探尋新的方法克服ELISA 技術的不足。

1.5 固相膜免疫分析技術

固相膜免疫分析技術屬于快速免疫檢驗技術，一般包括免疫層析試驗、免疫滲慮試驗、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡試驗。用于乙肝血清學標志物檢測的技術主要是免疫層析試驗，以硝酸纖維素膜等為固相載體，樣品溶液借助毛細作用在層析條上泳動，同時樣品中的待測物與層析材料上待測物的受體發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過目測或儀器檢測標記物聚集而得到直觀的實驗結果。這項技術多用于急診檢測及床旁檢測，但由于其檢測HBsAg 的靈敏度只有5 IU/mL［16］，人眼判斷結果主觀性較強，批量化操作相對較難等問題，在應用范圍方面受到一定的限制。

1.6 化學發(fā)光免疫分析技術

化學發(fā)光免疫分析技術是指伴隨化學反應過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象，由于化學反應產(chǎn)生電子能級處于激發(fā)態(tài)的物質，被激發(fā)的物質通過躍遷釋放能量產(chǎn)生光子，從而導致發(fā)光現(xiàn)象。按發(fā)光持續(xù)時間分為輝光型（glow）和閃光型（flash），輝光型發(fā)光時間在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘以上；閃光型發(fā)光時間在數(shù)秒內［17］。

1.6.1 化學發(fā)光技術分類及代表性廠家

化學發(fā)光檢測技術大體上可分為兩大類，即酶促與非酶促化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)。酶促化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)中作為標記物的酶基本不被消耗，而反應體系中發(fā)光劑的量充分過量，發(fā)光強度穩(wěn)定，發(fā)光時間長，常采用速率法檢測［18］。其中辣根過氧化物酶系統(tǒng)的標記物為辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP），以魯米諾（Luminol）及其衍生物作為發(fā)光底物［19］，安圖、強生等廠家的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)屬于此類；堿性磷酸酶系統(tǒng)的標記物為堿性磷酸酶（AP），以螺旋金剛烷環(huán)氧化物苯磷酸酯（3-［2-spiroadamatane］-4-methoxy-4-［3-phosphoryloxy］-phenyl-1，2-dioxetane）Dioxetane，AMPPD）作為發(fā)光底物［20］，邁瑞、西門子（德普）、希斯美康、貝克曼等廠家的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)屬于此類。非酶促化學發(fā)光檢測系統(tǒng)目前有三種方法，一是直接化學發(fā)光，作為標記物的化學物質如吖啶酯在堿性環(huán)境下，直接被過氧化物氧化產(chǎn)生發(fā)光信號，發(fā)光過程中標記物被消耗，發(fā)光信號持續(xù)時間短，檢測模塊需加裝進樣器［21］，雅培、西門子等廠家的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)屬于此類。二是通過電極上的電化學反應產(chǎn)生而不是由氧化劑或者發(fā)光劑產(chǎn)生，標記物為三聯(lián)吡啶釕衍生物即［Ru（bpy）3］2+，并以三丙胺為還原劑［22］，該技術是羅氏公司的專利。三是光激化學發(fā)光（LiCA）：如目標抗原可使兩個抗體上標記的感光珠和發(fā)光珠緊密的連接在一起，在680 nm 激發(fā)光下，可完成魯米諾氧化途徑化學發(fā)光過程［23］，國內科美公司的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)屬于此類。

1.6.2 磁微?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)特點及乙肝標志物應用

由于磁微粒本身具有大比表面和高分散穩(wěn)定性、超順磁性生物相容性、功能基特性、生物活性物質化學連接、類均相反應等特性［24］，賦予磁微粒化學發(fā)光檢測系統(tǒng)以下幾方面的特點：①靈敏度高，如采用魯米諾系統(tǒng)的化學發(fā)光法，檢測發(fā)光值的信號范圍0～10 億［25］。②反應迅速：屬于類均相反應，底物不需要終止直接發(fā)光，整體反應時間在17～56 min。③隨機單孔管理：具有樣本隨到隨測或急診功能，不存在加樣時間差。④自動化程度高：磁微?；瘜W發(fā)光分析儀集自動進樣、加樣、反應、檢測、打印報告等步驟于一體。⑤全封閉系統(tǒng)：磁微?；瘜W發(fā)光分析儀整個系統(tǒng)封閉，避免了人為因素帶來的檢測誤差，同時也提高了生物安全性。

化學發(fā)光免疫檢測技術由于上述各方面性能的優(yōu)勢，促進了乙肝血清學標志物由定性檢測向定量檢測轉變［26］。目前國內外主流產(chǎn)品可進行表面抗原和表面抗體的定量檢測，單位分別為IU/mL 和mIU/mL。而安圖生物率先在國際上研發(fā)和生產(chǎn)了基于磁微粒化學發(fā)光檢測技術的乙肝五項全定量全自動檢測系統(tǒng)，表面抗原和表面抗體均可以溯源至WHO 和國家標準物質；e 抗原、e 抗體、核心抗體也可以溯源至WHO 標準物質。乙肝五項全定量檢測賦予了乙肝血清學標志物新的內涵和臨床意義［27］，為深入研究乙肝自然史、抗病毒治療療效預測與監(jiān)測、乙肝疫苗免疫效果評價、推動精準醫(yī)療等提供了堅實可靠的平臺。

2 小結與展望

近年來，化學發(fā)光免疫分析方法及應用研究發(fā)展異常迅速，并以其獨特的優(yōu)勢在乙肝檢測領域得到了廣泛應用，特別是磁性微粒子的免疫分離技術、金納米粒子的催化功能以及化學發(fā)光共振能量轉移在化學發(fā)光免疫分析方法中的應用［28］。但是，化學發(fā)光免疫分析技術在實際應用中仍然存在不足，如核心技術智能化控制技術欠缺等［29］。為了使化學發(fā)光免疫分析技術得到更加廣泛的應用，未來研究的主要方向應集中在以下幾個方面：①分析儀器的大通量化與流水線化；②降低儀器成本，使儀器微型化、便攜化；③強化對檢測樣本基質的處理，減少非特異性吸附，提高檢測的穩(wěn)定性；④在高通量研究方面，完善多通道、多組分化學發(fā)光免疫分析檢測技術，提高檢測效率；⑤發(fā)展化學發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術，擴大應用范圍。

化學發(fā)光經(jīng)過近30年發(fā)展已成為臨床主要檢測技術之一。隨著檢驗分析技術的不斷進步，實驗室和臨床檢驗儀器從過去半自動化逐步向全自動化普及［30］，工作模式也從過去單臺儀器的自動工作發(fā)展到目前流水線作業(yè)的全實驗室自動化（Total laboratory automation，TLA）或稱為全程自動化，流水線和生化免疫聯(lián)機是大勢所趨。國產(chǎn)化學發(fā)光乙肝產(chǎn)品在新形勢下有著巨大的市場潛力，同時也將面臨著更加激烈、殘酷的競爭。如何提高檢測精準度、檢測穩(wěn)定性等方面或許是化學發(fā)光乙肝產(chǎn)品保持競爭力的核心問題。這也需要行業(yè)內所有的企業(yè)的共同努力，在競爭中成長、在成長中優(yōu)化，促進化學發(fā)光技術的長遠發(fā)展。

乙肝檢測技術從定性到定量的發(fā)展，需要解決溯源準確性的問題?；瘜W發(fā)光技術面臨當前及未來醫(yī)學發(fā)展的需求，在輔助臨床診斷之外，承擔起更多疾病的早期篩查、治療效果監(jiān)測及預后評估等任務時，就不得不要求更準確更科學的檢測結果。乙肝化學發(fā)光產(chǎn)品由定性向定量的功能升級轉換也對企業(yè)提出的更高要求。檢驗結果的溯源性將成為檢驗儀器、試劑生產(chǎn)以及臨床實驗室檢驗的重要質量指標，也必然受到IVD 廠商和醫(yī)學實驗室越來越多的重視。