李瓊 陳宇婷 接力剛 毋靜 杜紅延

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是常見的自身免疫性疾病，主要累及四肢小關(guān)節(jié)，造成關(guān)節(jié)破壞和畸形、喪失勞動(dòng)力甚至危及生命［1，2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)RA 發(fā)病率約為0.5%～1.0%，在我國(guó)約為0.4%，患者超過500 萬［1，3］?；颊叩年P(guān)節(jié)滑膜中存在多種免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，其中特定細(xì)胞亞群介導(dǎo)的免疫反應(yīng)失調(diào)可能在RA 發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single cell RNA sequence，sc RNA-seq）能夠從單個(gè)細(xì)胞分辨率下為人們展示細(xì)胞在各種環(huán)境下的狀態(tài)以及功能，打破以往利用有限的細(xì)胞標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性研究的局限性［4，5］?；趕c RNA-seq 的“人類細(xì)胞圖譜”項(xiàng)目的開展也將加深對(duì)人體組織中處于不同分化或疾病狀態(tài)細(xì)胞的理解［6］。這項(xiàng)技術(shù)在RA 的應(yīng)用也為鑒定組織中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞亞群和致病性駐留細(xì)胞亞群，以及揭示疾病機(jī)制提供有力工具。本文將對(duì)sc RNA-seq 技術(shù)原理、常用的測(cè)序平臺(tái)以及在RA中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（sc RNA-seq）技術(shù)

sc RNA-seq 的一般流程包括單細(xì)胞懸液的制備、細(xì)胞捕獲及裂解、逆轉(zhuǎn)錄及cDNA 擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及測(cè)序等，其中關(guān)鍵的兩個(gè)步驟為細(xì)胞捕獲與分子定量。細(xì)胞捕獲最常用的方法是利用微孔、微流或者微滴的技術(shù)；而定量主要有基于全長(zhǎng)或者標(biāo)簽兩種方法：前者獲取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本覆蓋度一致且獨(dú)特的全長(zhǎng)片段；后者則是通過標(biāo)簽探針，捕獲RNA 的5’或3’端序列進(jìn)行定性定量分析［7］。

2009年湯富酬團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了sc RNA-seq［8］，后又出現(xiàn)如Smart-seq2、MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 等技術(shù)。其中Smartseq2 可得到全長(zhǎng)的mRNA 序列，而MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 是將標(biāo)簽整合到cDNA 中［9］。不同的方法在原理以及靈敏度上有所差異，故應(yīng)該結(jié)合具體的生物學(xué)問題選擇最適合的平臺(tái)。而Smart-seq2 的主要優(yōu)勢(shì)在于可以得到的mRNA 全長(zhǎng)信息［5，10］。

sc RNA-seq 數(shù)據(jù)在細(xì)胞層面的分析主要包括細(xì)胞聚類和細(xì)胞軌跡推測(cè)，前者通過降維、無監(jiān)督聚類的算法對(duì)基因表達(dá)相似的細(xì)胞進(jìn)行分群；而后者則是使用最小生成樹的策略，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序，模擬出細(xì)胞的分化軌跡。在基因?qū)用娴姆治鲋饕ǚ治霾町惢虮磉_(dá)、鑒定細(xì)胞標(biāo)記、結(jié)合時(shí)間軌跡分析基因表達(dá)的變化情況、以及分析基因共表達(dá)模塊和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等［11］。此外，測(cè)序數(shù)據(jù)還可以結(jié)合單細(xì)胞甲基化、染色質(zhì)的可及性以及表面蛋白等數(shù)據(jù)共同分析，為疾病機(jī)制研究提供更加全面的策略［12］。

2 常用測(cè)序平臺(tái)

目前研究常用的平臺(tái)包括基于微滴的in-Drop［13］、Drop-seq［14］、10x Genomics［15］、基于微孔的BD Rhapsody［16］等高通量平臺(tái)，以及基于微流的C1 system（Fluidigm）［17］平臺(tái)等。InDrop、Drop-seq 和10x Genomics 均將細(xì)胞與微球包裹在微液滴中，用微球上獨(dú)特的條形碼區(qū)分細(xì)胞。這些平臺(tái)的主要差異在于條形碼的使用數(shù)量和微球的物理特性，如Drop-seq 比inDrop 的條形碼更多，可以處理更多的細(xì)胞，但缺點(diǎn)是細(xì)胞捕獲效率低（約1%）。而in-Drop 和10x Genomics 平臺(tái)的微球由水凝膠構(gòu)成，捕獲效率更高（前者約10%；后者約50%）［18］。10x Genomics 還可同時(shí)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表面蛋白測(cè)定［19］和TCR/BCR 測(cè)序［20］。BD Rhapsody 平臺(tái)在微孔中收集細(xì)胞，細(xì)胞溶解后釋放的mRNA 與細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合，同時(shí)系統(tǒng)還使用UMI 序列標(biāo)記mRNA，以減少擴(kuò)增偏差；可以實(shí)現(xiàn)靶向測(cè)序，降低實(shí)驗(yàn)成本［9］；可以結(jié)合BD AbSeq assays 同時(shí)分析轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)，為細(xì)胞分群提供更可靠的依據(jù)［16］。C1 system（Fluidigm）則是將單個(gè)細(xì)胞分配到各自反應(yīng)室，通過顯微鏡來區(qū)分細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)算捕獲細(xì)胞的數(shù)量，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解、RNA 逆轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增以及后續(xù)測(cè)序分析，其優(yōu)勢(shì)在于可以得到全長(zhǎng)mRNA 的信息，但捕獲細(xì)胞數(shù)量少、成本高且周期長(zhǎng)［17］。

3 sc RNA-seq在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用

3.1 繪制滑膜組織細(xì)胞圖譜

高通量sc RNA-seq 為細(xì)胞圖譜的建立奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，已發(fā)表的來自小鼠和健康人群各種組織的細(xì)胞圖譜也為進(jìn)一步研究病理組織中的細(xì)胞提供了包括細(xì)胞標(biāo)記物和細(xì)胞功能在內(nèi)的理論依據(jù)［21-22］。隨著sc RNA-seq 在RA 中的廣泛應(yīng)用，對(duì)滑膜細(xì)胞功能與狀態(tài)的理解也更加深入。2018年，Stephenson 等［23］開發(fā)了一種低成本的微流控技術(shù)，對(duì)RA 患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞進(jìn)行了Drop-Seq，利用無監(jiān)督聚類的算法，結(jié)合細(xì)胞特異性標(biāo)記物，將20387 個(gè)細(xì)胞細(xì)分成了包括3 種成纖維細(xì)胞、3 種T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等在內(nèi)的13 個(gè)細(xì)胞亞群，首次展現(xiàn)出一個(gè)全面的滑膜組織細(xì)胞圖譜。Zhang 等［24］利用流式細(xì)胞分選技術(shù)將CD4+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分選出來分別進(jìn)行CEL-Seq2，并整合RNA-seq 得到的數(shù)據(jù)，確定并闡述了4 種成纖維細(xì)胞亞群、4 種單核細(xì)胞亞群、3 種CD4+T 細(xì)胞亞群、3 種CD8+T 細(xì)胞亞群和4 種B 細(xì)胞亞型的特征。研究者進(jìn)一步對(duì)與疾病相關(guān)的基因如炎癥反應(yīng)和干擾素基因等在每群細(xì)胞的差異或公共表達(dá)進(jìn)行了分析，為尋找疾病干預(yù)靶點(diǎn)提供了思路。

3.2 鑒定關(guān)鍵細(xì)胞亞群

在針對(duì)疾病不同特征如持續(xù)的炎癥以及關(guān)節(jié)的破壞等發(fā)生機(jī)制的研究中，將sc RNA-seq 技術(shù)應(yīng)用于關(guān)注的細(xì)胞群體也可以幫助研究者尋找靶向性更高的治療方式。為了分析成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，Mizoguchi 等［25］對(duì)RA 和骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者滑膜組織的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了Smart-Seq2，結(jié)合表面蛋白的結(jié)果，確定了在RA 中顯著擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞亞群。這群細(xì)胞定位在滑膜的血管周圍，基因功能分析也揭示了其在免疫細(xì)胞募集和破骨細(xì)胞形成上的潛在作用。在針對(duì)巨噬細(xì)胞的研究中，Kuo 等［26］報(bào)道了HBEGF+炎癥巨噬細(xì)胞，這群細(xì)胞顯著表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的基因NR4A3、PLAUR 和CXCL2，以 及 生 長(zhǎng) 因 子HBEGF 和EREG，而對(duì)該群巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞作用軸的干擾也成為RA 治療的新方向。Stephan 等［27］證實(shí)了分化的CX3CR1+巨噬細(xì)胞的存在，這群細(xì)胞表達(dá)Trem2 和Vsig4 等免疫基因，并可以在滑膜襯里形成一個(gè)內(nèi)部免疫屏障，抑制關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。此外，為了鑒定出能夠分化為破骨細(xì)胞的亞群，研究者分選了CX3CR1hiLy6Cint細(xì)胞，在BD Rhapsody 平臺(tái)進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了由Foxm1 因子調(diào)節(jié)的具有破骨細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，也證實(shí)了Foxm1 具有調(diào)控特定巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用［28］。

3.3 單細(xì)胞多組學(xué)應(yīng)用

單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序可以通過優(yōu)化和整合基因組、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組提供的不同數(shù)據(jù)，全面分析單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特基因型、表型以及潛在的調(diào)控機(jī)制［29］。在RA 中，單細(xì)胞多組學(xué)的應(yīng)用集中于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組。在一項(xiàng)鑒定RA 中擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞克隆的定性和定量的特征的研究中，Ishigaki等［30］對(duì)RA 患者和健康人的外周血中的CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞TCR 分析，并對(duì)外周血與滑膜中顯著擴(kuò)增的CD4+T 細(xì)胞克隆進(jìn)行了sc RNA seq 分析，由此追蹤同一克隆內(nèi)基因表達(dá)的變化。此外，為了分析并驗(yàn)證更加穩(wěn)定的細(xì)胞分群，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以結(jié)合bulk RNA-seq 以及單細(xì)胞表面蛋白的數(shù)據(jù)。比如在鑒定RA 患者中驅(qū)動(dòng)炎癥的細(xì)胞亞群時(shí)，可以利用典型相關(guān)性分析算法整合bulk RNAseq 和sc RNA-seq 數(shù)據(jù)，同時(shí)應(yīng)用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行分群與驗(yàn)證［24］。既往研究已經(jīng)表明DNA 的甲基化和組蛋白修飾等是RA 發(fā)病的關(guān)鍵因素，因此未來對(duì)單細(xì)胞表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組的綜合分析也將有助于理解RA 的調(diào)控機(jī)制［31］。

3.4 sc RNA-seq 數(shù)據(jù)挖掘

基于sc RNA-seq 的數(shù)據(jù)挖掘已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究，幫助研究者發(fā)現(xiàn)新的思路或驗(yàn)證假說［32］。RA 的數(shù)據(jù)挖掘也已逐漸開展，Gawel 等［33］對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠模型的關(guān)節(jié)和淋巴結(jié)的sc RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路、潛在的生物標(biāo)記物以及藥物靶點(diǎn)等在各種細(xì)胞類型中存在差異，并構(gòu)建了疾病相關(guān)細(xì)胞類型和相互作用的網(wǎng)絡(luò)模型，用于系統(tǒng)性地分析可靠的生物標(biāo)記物和藥物。在一項(xiàng)驗(yàn)證外周血與關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)存在差異的meta 分析中，研究者也補(bǔ)充了sc RNA-seq 的數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)了血液和關(guān)節(jié)中共存的4 種細(xì)胞群炎癥反應(yīng)表達(dá)譜的差異，為假設(shè)提供了更多的支持證據(jù)［34］?；谕瑯拥乃悸?，Lewis 等［35］完善了免疫途徑在各種細(xì)胞亞群差異性激活的研究。進(jìn)一步的分析提示W(wǎng)NT、TGF-β、FcεRI 以及ERBB 信號(hào)通路對(duì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變起到調(diào)節(jié)作用，而這些變化的通路則可能為兩種疾病的治療提供方向［36］。

4 總結(jié)與展望

Sc RNA-seq 測(cè)序除了有助于鑒定細(xì)胞亞群，還可預(yù)測(cè)細(xì)胞在疾病進(jìn)展中的分化狀態(tài)。目前已經(jīng)成功對(duì)不同階段OA 患者的軟骨細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序和擬時(shí)間軌跡分析，揭示了疾病不同階段的基因表達(dá)譜變化，這提示在有關(guān)RA 的研究中也可以根據(jù)患者的不同發(fā)病階段分析基因表達(dá)譜的改變，尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)［37］。此外單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組的出現(xiàn)也可以在不丟失細(xì)胞空間信息的前提下研究細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用，識(shí)別不同細(xì)胞群在其空間背景下的特定功能［38］。因此，隨著sc RNA-seq 技術(shù)的完善以及在RA 中的廣泛應(yīng)用對(duì)骨膜組織內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)的研究將更加深入。且結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)以及空間轉(zhuǎn)錄組的信息，可從基因、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及組織微環(huán)境層面全面分析RA 的發(fā)病機(jī)制，為疾病分期、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和確定疾病早期診斷標(biāo)記物提供理論依據(jù)。