方 靜，朱 瓊，蔡 鵬，錢保勇

（泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州 225300）

活血止痛膠囊由當(dāng)歸、三七、乳香（制）、冰片、土鱉蟲、自然銅（煅）6味藥材組成,具有活血散瘀、消腫止痛之功效,用于治療跌打損傷、淤血腫痛等［1-3］,方中自然銅主要含有二硫化鐵,此外還有少量鋁、鈣、鎂、鈦、硅、砷,以及微量銅、鉛、鋅、錳、鎳、鉻等20余種元素［4］。不同價(jià)態(tài)、形態(tài)砷對人體毒性的差別很大,依次為亞砷酸鹽＞砷酸鹽＞一甲基砷＞二甲基砷＞砷甜菜堿＞砷膽堿［5-7］,故為了更好地對活血止痛膠囊毒性及用藥安全進(jìn)行評價(jià),應(yīng)對其砷形態(tài)進(jìn)行分析。

目前,國內(nèi)分析砷形態(tài)時(shí)主要采用選擇性好、靈敏度高的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICPMS）法［8-10］。本實(shí)驗(yàn)為了反映活血止痛膠囊經(jīng)口服進(jìn)入人體后可溶性砷的存在形態(tài),模擬人體胃腸道環(huán)境,環(huán)境將該制劑以水、人工胃液、人工腸液提取,并采用HPLCICP-MS法進(jìn)行分析,以期為其砷限量標(biāo)準(zhǔn)建立及用藥安全評價(jià)提供依據(jù)［11］。

1 材料

UltiMate3000型高效液相色譜儀,配置ICP-Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、IonPacTMAS7型陰離子交換樹脂柱（4 mm×250 mm）,采樣錐、截取錐均為鎳（美國Dionex公司）；Milli-Q Reference型超純水處理系統(tǒng)（美國密理博公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。

亞砷酸鹽［編號1604,含砷（75.7±1.2）μg/g］、砷酸鹽［編號1512,含砷（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷［編號16072,含砷（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷［編號1607,含砷（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜堿［編號1509,含砷 （38.8±1.1）μg/g］、砷膽堿 ［編號1512,含砷（28.0±1.1）μg/g］標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；Ba、Bi、Ce、Co、Zn、Li、U質(zhì)譜調(diào)協(xié)液（編號1323770,3～35 μg/L）均購自美國Thermo Scientific公司。碳酸銨（批號1000148）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜純,購自德國默克公司。

活血止痛膠囊共6批,批號分別為20161103 （江西百神藥業(yè)股份有限公司）、170211 （南京中山制藥有限公司）、1501026 （江西百神昌諾藥業(yè)有限公司）、15060162（珠海安生鳳凰制藥有限公司）、16060139 （珠海安生鳳凰制藥有限公司）、17010101 （珠海安生鳳凰制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 工作參數(shù) 流動(dòng)相200 mmol/L （NH4）2CO3（A）-10 mmol/L （NH4）2CO3（B）,梯度洗脫,程序見表1；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；等離子體功率1 550 W；采樣深度5 mm；載氣體積流量0.91 L/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速40 r/min；冷卻氣體積流量14 L/min；輔助氣體積流量0.8 L/min；采樣錐、截取錐類型鎳錐；標(biāo)準(zhǔn)采樣模式（STD）；手動(dòng)進(jìn)樣；采樣質(zhì)荷比m/z75 （砷）。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密稱取亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,超純水分別稀釋至1 041、1 006、1 001、1 004、1 019、1 005 μg/L（以砷計(jì)）,再用超純水各逐級稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度,分別為亞砷酸鹽1.04、2.08、4.16、8.33、16.7、20.82 μg/L,砷酸鹽1.01、2.01、4.02、8.05、16.10、20.12 μg/L,一甲基砷1.00、2.00、4.00、8.01、16.02、20.02 μg/L,二甲基砷1.00、2.01、4.02、8.03、16.06、20.08 μg/L,砷甜菜堿1.02、2.04、4.08、8.15、16.30、20.38 μg/L,砷膽堿1.00、2.01、4.02、8.04、16.08、20.10 μg/L。

2.3 提取液制備

2.3.1 人工胃液 按照2015年版《中國藥典》 四部通則0922［12］,取16.4 mL稀鹽酸,加水約800 mL、胃蛋白酶10 g,搖勻后加水稀釋至1 000 mL,即得。

2.3.2 稀鹽酸溶液 按照2015年版《中國藥典》 四部,取234 mL鹽酸,加水稀釋至1 000 mL,即得。

2.3.3 人工腸液 按照2015年版《中國藥典》 四部通則8004［12］,取6.8 g磷酸二氫鉀,加500 mL水溶解,0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另取10 g胰酶,加適量水溶解,將上述2種溶液混合,加水至1 000 mL,搖勻,即得。

2.4 樣品前處理

2.4.1 人工胃液提取物 精密稱取適量膠囊粉末至錐形瓶中,加入100 mL人工胃液,37 ℃下振蕩提取1 h,濾過,少量人工胃液清洗濾渣3次,合并濾液,加人工胃液定容至200 mL,搖勻,0.20 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.4.2 人工腸液提取物 人工胃液改成人工腸液,其他操作同“2.4.1” 項(xiàng),即得。

2.4.3 水提取物 精密稱取適量膠囊粉末至錐形瓶中,加100 mL水,37 ℃下振蕩提取5 h,濾過,少量水清洗濾渣3次,合并濾液,加水定容至200 mL,搖勻,0.20 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2” 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液,在“2.1”項(xiàng)工作參數(shù)下各進(jìn)樣25 μL測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,再分別為以S/N=3、S/N=10測定檢出限、定量限,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn) 取人工胃液（批號20161103）提取物適量,在“2.1” 項(xiàng)工作參數(shù)下進(jìn)樣測定6次,測得亞砷酸鹽、砷酸鹽峰面積RSD分別為0.96%、2.75% （一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿未檢測出）,表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 （批號20161103）,4 ℃下于0、2、4、6 h在“2.1” 項(xiàng)工作參數(shù)下進(jìn)樣測定,測得亞砷酸鹽、砷酸鹽峰面積RSD分別為1.08%、2.03%,表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取人工胃液提取液（批號20161103）10 mL,精密加入供試品溶液1、3、5 mL,混勻,平行3份,在“2.1” 項(xiàng)工作參數(shù)下進(jìn)樣測定,結(jié)果見表3。

2.9 樣品砷形態(tài)含有量測定 取6批膠囊,分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備水、人工胃液、人工腸液提取物,在“2.1”項(xiàng)工作參數(shù)下進(jìn)樣測定,平行6次,離子流色譜圖見圖1,結(jié)果見表4。由此可知,不同廠家、批次樣品中均只檢出無機(jī)砷（亞砷酸鹽、砷酸鹽）,以砷酸鹽為主,其總含有量差異較大,在人工胃液提取物中較高。

表3 各砷形態(tài)加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖1 各砷形態(tài)離子流色譜圖

表4 各砷形態(tài)含有量測定結(jié)果（μg/g， n=6）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了磷酸二氫銨、碳酸銨作為流動(dòng)相時(shí)的洗脫效果,發(fā)現(xiàn)前者易污染采樣錐,導(dǎo)致質(zhì)譜熄火,而后者能較好地避免該類情況發(fā)生,故選擇其作為流動(dòng)相。再通過不斷調(diào)節(jié)流動(dòng)相濃度及比例、更改洗脫時(shí)間,最終建立了同時(shí)測定活血止痛膠囊中亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿含有量。

前期報(bào)道,活血止痛膠囊無機(jī)砷在水、人工胃液、人工腸液中的溶出總量遠(yuǎn)低于總砷。2015年版《中國藥典》一部規(guī)定,活血止痛膠囊含砷量不得超過300 mg/kg［13］,但未涉及無機(jī)砷。因此,可考慮以亞砷酸鹽、砷酸鹽總含有量代表無機(jī)砷總含有量,從而制定相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),但其毒性和用藥安全仍需作進(jìn)一步研究。

表4顯示,不同廠家、批次活血止痛膠囊中無機(jī)砷含有量差異較大,可能與原藥材質(zhì)量不同有關(guān)。因此,可通過測定原藥材中無機(jī)砷含有量來將活血止痛膠囊中該類元素總量控制在安全范圍內(nèi)。