張二飛，殷 紫，齊 越

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003；2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇淮安 223005；3.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇徐州 221116）

帕金森?。≒arkinson’s disease,PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,在1817年被首次發(fā)現(xiàn)并命名［1］。其主要臨床癥狀表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直等現(xiàn)象［2］。PD的病因尚不明確,致病機(jī)制復(fù)雜多樣,目前研究認(rèn)為包括環(huán)境因素、細(xì)胞中亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的破壞、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等［3］。而神經(jīng)炎癥是眾多退行性疾病和衰老的主要病理特征之一,其中介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎因子,損傷血腦屏障和神經(jīng)突觸,引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的失衡［4］。目前,關(guān)于針對(duì)神經(jīng)炎癥臨床治療的藥物尚不能有效地控制PD的發(fā)展與不良反應(yīng)的產(chǎn)生,因此,深入對(duì)神經(jīng)炎癥的機(jī)制研究,開發(fā)具有多靶點(diǎn)、安全有效的治療藥物尤為重要。大量基礎(chǔ)研究與現(xiàn)代藥理學(xué)分析顯示：白藜蘆醇（resveratrol,RSV）具有抗炎、抗氧化損傷等多種作用［5-7］。本研究通過研究白藜蘆醇對(duì)LPS和ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡作用的影響,深入探討其作用機(jī)制,以期為神經(jīng)炎癥的體外細(xì)胞水平研究增加新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 蛋白凝膠電泳-電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國Biorad公司）；BCA蛋白定量雙波長酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī)（美國ThermoFisher公司）；ECL曝光顯影系統(tǒng) （美國 GE Healthcare公司）；Hoechst熒光顯微鏡 （日本NIKON公司）；白藜蘆醇（美國Selleck公司,批號(hào)S1396）；胰酶（碧云天生物技術(shù)公司,批號(hào)C0202-100 ml）；胎牛血清（FBS,美國ThermoFisher-GIBCO公司,批號(hào)10099-141）；F12-DMED （美國 ThermoFisher-GIBCO公司,批號(hào)C11330500BT）；脂多糖 （LPS,美國Sigma-Aldrich公司,批號(hào)L2880-25 mg）；三磷酸腺苷（ATP,美國Selleck公司,批號(hào)S1985）；RIPA裂解液（江蘇凱基生物公司,批號(hào)KGP703-100）；Hoechst熒光染料（美國ThermoFisher-Invitrogen公司,批號(hào)H1399）；磷酸鹽緩沖液（PBS,江蘇凱基生物公司,批號(hào)KGB003）；甘油（江蘇凱基生物公司,批號(hào)KGT519100）；一抗兔抗TLR4 （1 ∶ 1 000,英國Abcam公司,批號(hào)ab13556）；兔抗p-NF-κB （1 ∶1 000,美國CST公司,批號(hào)3033）；兔抗NF-κB （1 ∶1 000,美國CST公司,批號(hào)8242）；兔抗IL-1β （1 ∶1 000,美國CST公司,批號(hào)83186）；鼠抗BCL-2 （1 ∶1 000,美國CST公司,批號(hào)15071）；兔抗BAX （1 ∶1 000,美國CST公司,批號(hào)5023）；鼠抗ACTIN （1 ∶2 000,Santa公司,批號(hào)SC-47778）；二抗Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP與Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP （美國Invitrogen公司,批號(hào)31460,批號(hào)62-6520）。

1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞來源 本研究所用小膠質(zhì)細(xì)胞為原代小膠質(zhì)細(xì)胞,取新生1～3 d C57/B6乳鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)所用小鼠購自于南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0001。

1.3 離體細(xì)胞水平研究與實(shí)驗(yàn)分組 本研究中所使用細(xì)胞為小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞。1～3 d新生C57乳鼠通過剝離腦膜,去除腦膜上血絲后,使用0.25%胰酶消化腦組織,過40 μm細(xì)胞篩網(wǎng),所得濾液離心,1 500 r/min離心10 min,將離心所得細(xì)胞沉淀重懸后鋪種于T25瓶中,加6 mL含有10% fatal bovine serum （FBS）Gibco-F12/DMED培養(yǎng)基,次日更換新鮮培養(yǎng)基,后隔3 d換液,細(xì)胞培養(yǎng)至10～12 d可見小膠質(zhì)細(xì)胞長出,用力平搖T25小瓶,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)基后離心,1 500 r/min離心10 min,所得細(xì)胞沉淀即為小膠質(zhì)細(xì)胞,種于24孔板后,次日貼壁,可用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)分為空白組、LPS+ATP組、白藜蘆醇組和LPS+ATP+白藜蘆醇組。LPS刺激劑量為100 ng/mL （6 h）,ATP為5 mmol/L （30 min）；白藜蘆醇預(yù)提前給藥3 h,給藥劑量一次為25 μmol/L。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA裂解液裂解（含蛋白酶與磷酸酶抑制劑）細(xì)胞蛋白后,刮取細(xì)胞蛋白,離心16 000 r/min,15 min,棄EP管底部沉淀,吸取上清細(xì)胞蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量后,加入5×loading buffer,95 ℃煮沸蛋白使之變性用于后續(xù)電泳。細(xì)胞蛋白通過電泳、電轉(zhuǎn)將蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF （聚偏二氟乙烯）膜后,使用5% TBST脫脂牛奶封閉條帶1 h后,孵育特異性一抗4 ℃過夜（檢測(cè)指標(biāo)為：兔抗TLR4；兔抗p-NF-κB；兔抗NF-κB；兔抗 IL-1β；鼠抗 BCL-2；兔抗 BAX；鼠抗ACTIN）,次日孵育二抗1 h ［Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP與Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP］,TBST洗膜10 min×3次,ECL曝光顯影。

1.5 細(xì)胞上清的提取 收集細(xì)胞上清后,離心1 000 g,5 min,去除死細(xì)胞,小心吸取600 μL上清至另一干凈EP管中,加入等體積預(yù)冷的甲醇和1/4體積氯仿,迅速渦旋震蕩后離心,吸棄上清,加入500 μL預(yù)冷甲醇后,渦旋震動(dòng)離心,13 000 r/min離心5 min,小心吸棄上清,將裝有沉淀物的EP管置于37 ℃的烘箱中5 min,加入30 μL的2.5×loading buffer溶解,95 ℃煮沸5 min后上樣進(jìn)行Western blot分析IL-β 炎癥因子。

1.6 Hoechst細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),染色質(zhì)有固縮現(xiàn)象,經(jīng)Hoechst染色后,在熒光顯微鏡下觀察,正常細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色,而發(fā)生凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)致密濃染,藍(lán)色較淡。每組小膠質(zhì)細(xì)胞種于24孔爬片中進(jìn)行檢測(cè)分析,細(xì)胞處理后,吸棄培養(yǎng)基,加入磷酸鹽緩沖液（PBS）潤洗3次,每孔加入500 μL Hoechst染料稀釋液（1 ∶3 000稀釋）。室溫孵育15 min,吸棄染料,PBS潤洗3次后,將爬片從24孔板取出,倒扣至載玻片上,PBS加甘油（1 ∶1）封片保存,用于后續(xù)顯微鏡拍攝。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析使用Graphpad prism7軟件,圖例展示均用 （）表示,采用one-way ANOVA和Student’ s t-test進(jìn)行組間差異分析。 P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制由LPS和ATP誘發(fā)的TLR4/NF-κB/IL-1β 信號(hào)通路的激活 原代小膠質(zhì)細(xì)胞種于24孔板后,次日貼壁后可用于實(shí)驗(yàn)研究,白藜蘆醇提前預(yù)孵育3 h,后給予炎癥的第一信號(hào)LPS刺激6 h,炎癥第二信號(hào)ATP刺激30 min。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LPS+ATP組TLR4/NF-κB/IL-1β 信號(hào)通路被明顯激活,其中LPS+ATP組與空白組相比,TLR4受體上調(diào)最為明顯,磷酸化的NF-κB蛋白上調(diào),細(xì)胞分泌的成熟體IL-1β 也增多 （P＜0.01）。LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組相比,則減弱了TLR4/NF-κB/IL-1β 信號(hào)通路的激活,TLR4受體下調(diào)明顯,磷酸化NF-κB蛋白下調(diào)最明顯,細(xì)胞分泌的成熟體IL-1β也減少（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2 白藜蘆醇對(duì)炎癥刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡蛋白的影響 通過檢測(cè)原代小膠質(zhì)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),與空白組比較,LPS+ATP誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡反應(yīng),表現(xiàn)為BCL-2的顯著降低（P＜0.01）,BAX水平的顯著升高（P＜0.01）。而提前預(yù)給白藜蘆醇,LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組比較,改善了LPS+ATP引發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,BCL-2升高（P＜0.05）,BAX水平降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

表1 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達(dá)的影響（， n=4）

表1 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達(dá)的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,*P＜0.05。

圖1 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達(dá)的影響（， n=4）

圖2 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞BAX、BCL-2表達(dá)的影響（， n=4）

2.3 白藜蘆醇對(duì)炎癥刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),染色質(zhì)有固縮現(xiàn)象,經(jīng)Hoechst染色后,在熒光顯微鏡下觀察,正常細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色,而發(fā)生凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)致密濃染,藍(lán)色較淡。在本研究中,小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS+ATP刺激下染色質(zhì)有固縮現(xiàn)象且細(xì)胞核藍(lán)色較淺,與空白組比較,細(xì)胞發(fā)生凋亡損傷（P＜0.01）,而提前預(yù)孵育白藜蘆醇后,LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組比較明顯改善了凋亡現(xiàn)象（P＜0.01）。提示白藜蘆醇可改善由LPS+ATP引起的細(xì)胞凋亡損傷。見圖3、表3。

表2 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞BCL-2、BAX表達(dá)分析的影響（， n=4）

表2 白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞BCL-2、BAX表達(dá)分析的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,*P＜0.05。

表3 Hoechst染色分析白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（， n=4）

表3 Hoechst染色分析白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,**P＜0.01。

圖3 Hoechst （×100）染色分析白藜蘆醇對(duì)LPS+ATP模型原代小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（， n=4）

3 討論

帕金森病是由多種環(huán)境因素、生物因素介導(dǎo)的慢性神經(jīng)退行性疾病,在65歲以上老年人群中患病率達(dá)2%～3%,其主要特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失與路易小體的沉積［8］。隨著帕金森病進(jìn)程的不斷加深,臨床癥狀常表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩加劇,腦內(nèi)基底核、海馬等多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)受損,并伴有嚴(yán)重的抑郁癥狀與非運(yùn)動(dòng)癥狀［9］。

目前關(guān)于帕金森病的治療主要包括藥物治療、手術(shù)治療、心理疏導(dǎo)等方面。其中藥物治療是帕金森病主要的治療方式。臨床上主要是通過藥物以達(dá)到多巴胺替代來緩解癥狀的目的。然而,長期服用左旋多巴和多巴胺受體激動(dòng)劑會(huì)出現(xiàn)異動(dòng)癥等不良反應(yīng)［10］。由于帕金森病致病機(jī)制的多樣性與臨床病理表現(xiàn)的復(fù)雜性,單一的靶點(diǎn)藥物已不能有效地緩解其病癥,因而亟待研發(fā)安全性高、多靶點(diǎn)的活性藥物來治療帕金森病。

由于目前藥物治療存在“劑末效應(yīng)” 等多種不良反應(yīng),開發(fā)多靶點(diǎn)安全性高的藥物用于臨床治療。與現(xiàn)代藥理學(xué)相比,傳統(tǒng)醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)以及整體調(diào)節(jié)等作用,白藜蘆醇具有抗炎抗氧化對(duì)代謝性疾病和神經(jīng)退行性疾病都有相應(yīng)的治療作用?；A(chǔ)研究中報(bào)道：在機(jī)體受損的細(xì)胞中,白藜蘆醇可通過激活PI3K/AKT （磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B）信號(hào)通路,下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白BAX的表達(dá)［11］。在本研究中,課題組使用LPS+ATP建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型,探討白藜蘆醇改善炎癥效應(yīng)的機(jī)制。

近年來,隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入,人們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞在介導(dǎo)中樞神經(jīng)炎癥中的作用了解也不斷加深［12-13］。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)元的發(fā)育成熟等起著關(guān)鍵作用。靜息狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)長的突觸,而一旦接受危險(xiǎn)信號(hào)刺激后,由靜息態(tài)轉(zhuǎn)變成活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)引發(fā)大量促炎因子的產(chǎn)生誘導(dǎo)自身的凋亡反應(yīng),破壞腦穩(wěn)態(tài)的平衡［14-15］。研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞表面的多種模式識(shí)別受體是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要執(zhí)行者,其TLRs （Toll樣受體）家族在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用,通常TLR4與危險(xiǎn)相關(guān)分子模式或病原相關(guān)分子模式結(jié)合后,激活下游NF-κB通路,促進(jìn)pro-caspase-1 （caspase-1前體蛋白）與Pro-IL-1β （白細(xì)胞介素前體-1β）的轉(zhuǎn)錄和炎癥小體的組裝等,后CASPASE1 （半胱天冬酶1）切割誘導(dǎo)成熟IL-1β的產(chǎn)生參與神經(jīng)損傷作用［16-18］。本實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4受體的表達(dá),從而減少了NF-κB的激活,下游炎癥相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄減少,從而抑制了炎癥因子IL-1β 的生成。

Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)。Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類：一類是具有抑制凋亡作用,Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白,其表達(dá)量上調(diào)可抑制細(xì)胞的凋亡；一類具有促進(jìn)凋亡作用,Bax則是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白,其表達(dá)量上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bax受細(xì)胞凋亡信號(hào)的影響,可在線粒體膜上產(chǎn)生蛋白孔道,釋放線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C,激活線粒體通路下游caspase家族蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡［19-21］。研究表明,基于細(xì)胞炎癥反應(yīng)的治療可改善細(xì)胞的凋亡損傷水平。本研究中,在小膠質(zhì)細(xì)胞中提前預(yù)孵育白藜蘆醇改善了LPS+ATP引發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,逆轉(zhuǎn)了BCL-2的降低與BAX水平的升高的現(xiàn)象。同時(shí)Hoechst染色發(fā)現(xiàn),提前預(yù)孵育白藜蘆醇后改善小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核致密濃染,藍(lán)色較淡的現(xiàn)相,提示白藜蘆醇改善了小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

綜上所述,白藜蘆醇可能通過抑制TRL4/NF-κB/IL-1β信號(hào)通路改善了帕金森病中小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥誘發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,同時(shí)這一研究成果可結(jié)合相應(yīng)的臨床分析數(shù)據(jù),以期為后續(xù)靶向小膠質(zhì)細(xì)胞藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。