李志國， 楊先照， 李小科， 馬 潯， 王 姍， 張 梅， 葉永安

1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 a.消化科； b.檢驗科， 北京 100700； 2 北京中醫(yī)藥大學 肝病研究所， 北京 100700； 3 北京杏園金方國醫(yī)醫(yī)院， 北京 101300

1 肝臟分區(qū)與氧氣的關系

氧氣對所有活細胞至關重要，其在體內的運輸受到組織或器官代謝需求和功能狀態(tài)的調節(jié)[1]。肝臟獨特的解剖結構，影響其生理功能和氧氣穩(wěn)態(tài)[2]：肝臟分別通過肝動脈和肝門靜脈接受高氧血液和乏氧血液。在肝臟中，從門靜脈和肝動脈到中心靜脈的單向血流(即門靜脈區(qū)60～65 mm Hg，中央靜脈周圍區(qū)域30～35 mm Hg)在肝臟實質內形成氧梯度[3]。

肝臟的基本結構單位是肝腺泡。依據(jù)氧張力的不同形成3個不同代謝能力和酶含量的區(qū)域(門靜脈周圍區(qū)域糖異生能力更強，而中央靜脈周圍區(qū)域糖酵解能力更強)[4]，從而將肝腺泡分為3個功能帶：近匯管區(qū)為Ⅰ帶，此區(qū)域肝細胞最先獲得新鮮血源，代謝活躍，再生能力強；近中央靜脈周圍區(qū)域為Ⅲ帶，此區(qū)域肝細胞營養(yǎng)較差，對有害物質的抵抗力低，再生能力弱；位于二者之間的為Ⅱ帶，此區(qū)域肝細胞的營養(yǎng)、代謝及再生能力均介于前兩者之間。不同肝腺泡區(qū)域的結構、功能不同，中央靜脈周圍區(qū)域比門靜脈周圍區(qū)域(匯管區(qū))更易受到極度缺氧的影響[3]。

肝細胞在不同氧張力下的生理暴露影響其對缺氧應激的能力。在接近門靜脈周圍氧張力條件下培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞較在接近中央靜脈周圍氧張力條件下存活時間長[5]。表明在缺氧的情況下(如肝代謝需求增加、組織缺血等)，當氧張力低于閾值時，中央靜脈周圍的肝細胞可能會受到更大的損傷[6]。

2 肝病的缺氧微環(huán)境

缺氧微環(huán)境是在致病因素作用下，組織細胞局部因炎癥損傷等引起缺氧而形成。肝損傷引起的血管紊亂和微環(huán)境缺氧，在發(fā)病早期已經開始。缺氧是急慢性肝病重要的微環(huán)境特征，也是導致肝損傷及炎癥發(fā)生的重要因素[4]。低氧不僅是細胞損傷和炎癥的促進因素[7]，亦是肝再生的抑制劑、血管生成和纖維生成的主要刺激物以及肝癌的啟動因素。目前發(fā)現(xiàn)最重要的缺氧應激因子是缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，缺氧的許多效應均由HIF-1α介導[4]。

2.1 肝損傷與缺氧微環(huán)境 “常氧”和“缺氧”取決于器官適應的正常氧張力，盡管在健康肝臟中存在氧張力的變化，但未觀察到缺氧反應[8]。然而，肝臟的特殊結構和肝細胞的高代謝需求使其易受缺氧影響，在病毒性肝炎、脂肪性肝炎、肝纖維化(肝硬化)和肝癌等肝臟受損及繼發(fā)炎癥時，均伴有缺氧現(xiàn)象[6,9-10]。例如肝病時出現(xiàn)的肝細胞腫脹、肝血管收縮、肝竇狹窄，肝竇毛細血管化，肝竇間隙膠原纖維沉積，乃至肝細胞再生結節(jié)和纖維間隔形成，肝內血管網(wǎng)異常，以及由于肝功能受損、腸源性內毒素促使內皮素增多等均可導致或加重肝內缺氧，形成肝臟缺氧微環(huán)境，而使微環(huán)境缺氧貫穿于肝病發(fā)生發(fā)展的始終。

2.2 肝纖維化/肝硬化與缺氧微環(huán)境 慢性肝損傷引起缺氧和肝纖維化。肝星狀細胞(HSC)在纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[11]。在由酒精、肝炎病毒、遺傳性疾病等引起的慢性肝損傷期間，細胞因子刺激HSC活化為肌成纖維細胞，并刺激其增殖和產生膠原，這是導致肝纖維化發(fā)生的關鍵步驟[12]。慢性肝損傷期間的缺氧微環(huán)境可能是HSC活化的重要刺激因素[13]。缺氧刺激HSC釋放多種介質，這些介質影響纖維化的進展，例如HSC在缺氧條件下合成并釋放血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素-1[14-15]。血管生成促進肝纖維化，而HSC促進血管生成介質的產生，因此血管生成和肝纖維化是相互促進的[16]。

在肝纖維化過程中伴隨的肝臟缺氧通過HIF-1上調HSC與肝竇內皮細胞中的VEGF和血管生成素等基因表達，誘導肝竇內皮細胞向毛細血管內皮轉化[17]，導致肝竇表面的篩孔數(shù)量明顯減少甚至消失，這種肝內結構的異常改變將促進肝纖維化進展，導致肝內血管阻力增加、門靜脈高壓形成[4]。

肝硬化時肝細胞缺氧除由肝內動靜脈分流、肝竇減少和肝竇毛細血管化[18]所致外，還受HSC在肝血竇管腔密度增大和覆蓋增多、血管收縮因子過多[19-20]等影響。HSC具有收縮特性，其可引起肝竇血管收縮，入肝血流減少而加重缺氧。此外，缺氧及HIF-1上調內皮素-1、內皮素-1受體及內皮素-B受體引起的血管收縮進一步加劇微環(huán)境缺氧[4]。

2.3 肝細胞癌(HCC)的缺氧微環(huán)境 HCC組織細胞生長所處的氧分壓較正常肝組織低[21]，這種缺氧環(huán)境不僅對HCC的發(fā)生發(fā)展十分重要，而且在誘導HCC細胞耐藥、血管形成等多個方面發(fā)揮重要作用。HCC與其他實體腫瘤類似，都具有缺氧的特征，特別是在血管生成不能滿足腫瘤快速生長的代謝需求時[22]。一方面，缺氧誘導腫瘤壞死，限制HCC細胞增殖；另一方面，缺氧導致HCC細胞開啟缺氧反應，誘導血管生成以及腫瘤侵襲和轉移。肝硬化基礎上發(fā)生的HCC同時具有肝硬化的缺氧微環(huán)境特征。

為了適應缺氧微環(huán)境，腫瘤的新陳代謝方式會發(fā)生相應改變，正常組織主要通過有氧呼吸獲得能量，而腫瘤細胞的能量主要來自無氧糖酵解，即使氧含量正常，腫瘤細胞也主要依賴無氧糖酵解獲取能量，這一現(xiàn)象稱為Warburg效應。在缺氧狀態(tài)下，HCC細胞可以選擇糖酵解等機制獲取能量并繼續(xù)增殖[23]。從氧化磷酸化向無氧糖酵解的轉變是腫瘤細胞能夠在缺氧微環(huán)境中存活的重要前提，在此過程中HIF-1α起到至關重要的作用。HIF-1α能夠直接激活乳酸脫氫酶A(LDHA)、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK-1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)和葡萄糖載體蛋白1(GLUT-1)等基因，這些基因編碼的葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶是腫瘤細胞無氧糖酵解所需。目前研究已證明PKM2[24]、GLUT-1[25]是腫瘤細胞Warburg效應的重要調控因子。

3 HIF的結構及調節(jié)

3.1 HIF的結構及分類 為了適應環(huán)境中不同氧氣水平，生物體開發(fā)出氧氣傳感系統(tǒng)，觸發(fā)適應性轉錄以維持穩(wěn)態(tài)。在缺氧條件下，HIF轉錄活性增強導致參與細胞功能的各種基因表達增強，從而促進體內細胞代謝、增殖和遷移。目前有3種已知的HIF轉錄因子：HIF-1、HIF-2和HIF-3，它們是由HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α與HIF-1β亞單位組成的3種異二聚體復合物[8,26]。HIF-1β又被稱為芳香烴受體核轉運蛋白，在細胞核內表達不受氧濃度影響，其主要作用是維持HIF的結構穩(wěn)定[27]。α亞單位通過氧誘導的蛋白降解進行調節(jié)，HIF-1α與HIF-2α亞基均受氧氣濃度影響，缺氧可誘導其高表達。

HIF中最重要的轉錄因子是由HIF-1α及HIF-1β組成的HIF-1，其廣泛表達于機體各組織及細胞，參與哺乳動物細胞中氧平衡調節(jié)[28]。HIF-1適應細胞和組織中的低氧會導致一系列與血管生成(主要是VEGF)、紅細胞生成、葡萄糖攝取及代謝、細胞增殖和生存有關的基因的轉錄誘導[26,29]。

3.2 HIF的氧依賴性調節(jié) 細胞通過協(xié)調轉錄反應來適應低氧，這一反應由HIF調節(jié)[30]。HIF通過結合靶基因中被稱為低氧反應元件的特異性DNA序列來調節(jié)信號傳導事件，導致其轉錄增加或減少[27]。盡管HIF轉錄因子在缺氧條件下穩(wěn)定，但在“正?！毖醴謮合拢邢蚋滨埢桓滨Ａu化酶結構域包含蛋白(PHD)羥基化后，羥基化的HIF-α與von Hippel-Lindau(VHL)相互作用，激活泛素酶系統(tǒng)，導致HIF-1α亞單位迅速降解，故正常氧濃度情況下HIF-1α表達較低[31-32]。在缺氧條件下，PHD活性降低，導致HIF-1α亞單位穩(wěn)定表達，并通過N末端和C末端激活域與其調節(jié)元件[31]結合，進而形成轉錄激活復合物。

另一種氧敏感性羥化酶，即缺氧誘導因子抑制因子(factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH)，亦調節(jié)HIF-1α的表達。FIH可使HIF-1α的C末端反式激活結構域中天冬酰胺酰殘基羥基化，但不抑制異二聚體HIF-1α與其轉錄共激活因子的結合[33]。FIH限制HIF-1α的C末端反式激活結構域的活性，但不限制N末端結構域的活性，這對于缺氧反式激活的基因具有重要意義，因這一特征，細胞可以表現(xiàn)出雙相HIF-1α依賴性轉錄特征：在中度缺氧下為PHD失活型，在嚴重缺氧下為PHD和FIH共同失活型[34]。

3.3 HIF的非氧依賴性調節(jié) 除了缺氧之外，HIF-1α還可以通過其他介質被激活，包括細胞因子、生長因子和氧化應激[35]。細胞表面受體，例如G蛋白偶聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶促進HIF-1α mRNA 翻譯和反式激活活性[8]。Luo等[36]發(fā)現(xiàn)了PKM2的新作用，該酶催化糖酵解的最后一步，并作為HIF-1α和HIF-2α的共激活因子。有研究[37]顯示在肝癌異種移植動物模型中，PI3K抑制劑可阻斷HIF-1α，表明HIF-1α的激活受PI3K/Akt通路調控。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細胞生長和增殖的整體調節(jié)劑，其可通過細胞翻譯和轉錄的特異性激活來調節(jié)HIF表達，許多報道[38-39]顯示細胞通過PI3K/AKT/mTOR途徑進行HIF相關的調節(jié)。

4 HIF與肝病的關系

4.1 HIF與肝損傷 肝損傷引起微環(huán)境缺氧，而缺氧進一步加重肝損傷及炎癥，HIF在其中發(fā)揮重要作用。Morello等[40]證明HIF-2α通過觸發(fā)肝細胞釋放富組氨酸的糖蛋白驅動非酒精性脂肪性肝炎。細胞實驗[41]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物千層紙素A可通過抑制HIF-1α改善乙醇誘導的肝脂肪變性和炎癥。新近研究[42]表明，缺氧微環(huán)境中癌細胞和腫瘤相關巨噬細胞(腫瘤內的主要促炎細胞)之間的HIF-1α/IL-1β信號傳導環(huán)，促進癌細胞上皮-間質轉化和轉移。這些研究探討了缺氧及HIF與肝臟炎癥損傷，以及炎癥與肝癌的關系，為肝炎的治療提供了新的契機。

4.2 HIF與肝纖維化 肝纖維化是所有慢性肝病的共同途徑，肝纖維化持續(xù)進展，最終導致肝硬化。肝纖維化的形成伴隨著膠原和細胞外基質(ECM)的積累。肝臟中的HSC在肝纖維化發(fā)展中起關鍵作用[11]?；罨腍SC和肌成纖維細胞(myofibroblast, MF)遷移促進了肝纖維化的進展[43]。HIF-1α調節(jié)缺氧時HSC的活化，這對于膠原沉積和血管生成尤為重要[44-45]。HIF-1α在肝纖維化發(fā)展中的作用已在HIF-1α基因敲除小鼠的實驗中明確鑒定[44]，表明缺氧和HIF-1α募集先于纖維化發(fā)生，HIF-1α的肝細胞特異性沉默導致ECM沉積顯著減少。在從手術標本切片分離的人HSC中，通過缺氧激活HIF-1α，證明HIF-1α是刺激HSC和MF遷移的啟動因素；HIF-1α的有效沉默導致HSC和MF遷移顯著抑制，表明HIF-1α在人肝纖維化的發(fā)展中具有不可或缺的作用[46]。近期動物實驗[47]表明，異氯酸B通過microRNA-122/HIF-1α信號通路抑制多種促纖維化因子，對非酒精性脂肪性肝炎相關的肝纖維化具有顯著的保護作用。

4.3 HIF與肝癌前病變 HIF-1α和HIF-2α活化與肝細胞惡性轉化存在明顯聯(lián)系。由于肝硬化為HCC的高危因素，因此確定HIF是否是肝硬化進展為癌癥的驅動力具有重要意義。對肝細胞發(fā)生惡性轉化的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在肝細胞發(fā)生變性階段，HIF-1α mRNA轉錄增加和HIF-1α過表達，在肝細胞發(fā)生變性、癌前病變和癌變的不同發(fā)展階段，HIF-1α基因及蛋白呈動態(tài)進行性表達，且血清HIF-1α表達情況與肝組織平行，整個過程中HIF-1α基因序列與GenBank源序列一致。有研究[48]表明，肝細胞惡性轉化過程中HIF-1α mRNA轉錄和HIF-1α蛋白表達在癌前病變和HCC形成階段達到高峰。

4.4 HIF與HCC 缺氧驅動的血管生成是組織再生、炎癥和腫瘤生長的突出特征，HIF-1和HIF-2對低氧誘導的血管生成有重要影響[29]。作為低氧反應的主要介質之一，HIF-1是激活缺氧反應的基因，該基因參與腫瘤發(fā)生和癌癥進展的多個方面，包括增殖、代謝、血管生成、侵襲、轉移和耐藥[22]。HCC微環(huán)境中高水平的HIF-1導致HCC細胞的增殖和存活能力增強，HIF-1過表達與HCC的不良預后相關[22]。有研究[49]證實，HIF1α通過增加HCC細胞中的SNAI1轉錄促進上皮-間質轉化。臨床HCC組織研究[50]證實HIF-1α和賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyloxidase-like 2，LOXL2)呈正相關，HIF-1α和LOXL2的高表達與血管生成擬態(tài)的形成及不良預后有關，并發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過調節(jié)LOXL2誘導上皮-間質轉化，HCC細胞遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)形成。

此外，HIF與抗腫瘤治療中出現(xiàn)的耐藥相關[51]。HIF的高表達與HCC靶向藥物索拉非尼耐藥現(xiàn)象之間存在關聯(lián)，目前索拉非尼治療與HIF抑制劑的組合已被證明是在體外和體內克服索拉非尼耐藥的方法[52]。近期研究[53]表明，肝癌缺氧微環(huán)境中HIF-1α誘導的髓樣細胞-1(TREM-1)陽性腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)啟動腫瘤免疫抑制，是造成肝癌抗程序性死亡配體-1治療抵抗的主要原因。

5 小結

缺氧微環(huán)境是肝病的一種普遍現(xiàn)象，貫穿于肝病發(fā)生發(fā)展的始終。HIF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的缺氧應激因子，與肝細胞的炎癥損傷、纖維化的形成、肝細胞的惡性轉化密切相關，并在肝癌發(fā)生階段起重要作用。針對肝病各個階段亟需新藥物的開發(fā)，當前有關HIF作用機制的研究為肝病各階段的治療提供了新策略。但需要進一步明確缺氧與肝病進展的確切機制，以及深入研究缺氧微環(huán)境與炎癥和免疫等方面的關系。以期通過干預或調節(jié)缺氧微環(huán)境或其中的某一或某些靶點來改善肝臟疾病。