邢愛萍 胡曉蕓 武曉蘭

1山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院全科醫(yī)學科，太原030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，太原030001；3太原市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，太原030002

肺動脈高壓是多種原因引起的嚴重的慢性肺循環(huán)疾病，肺血管重塑是肺動脈高壓形成的重要病理基礎(chǔ)。吸煙是支氣管、肺疾病的主要危險因素[1]。目前，吸煙對肺血管的直接作用引起學術(shù)界的廣泛關(guān)注。有研究表明，香煙煙霧可以直接作用于肺血管系統(tǒng)，導致肺血管重塑，進而發(fā)生肺動脈高壓[2]。但其機制目前尚未明確。本實驗通過建立煙霧暴露大鼠模型，觀察肺血管形態(tài)及壓力變化，并使用透射電鏡觀察肺小動脈的超微結(jié)構(gòu)，探討吸煙對肺血管損害的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用卷煙為上海卷煙廠產(chǎn)大前門牌卷煙，每支含焦油13 mg，煙堿1.0 mg，一氧化碳14 mg。小鼠α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 清潔級雄性SD 大鼠40只，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，體質(zhì)量(200±30)g，隨機數(shù)字表法分為對照(C)組、煙霧暴露1 個月 (S1m)組、煙霧暴露2 個月(S2m)組、煙霧暴露3個月 (S3m)組，每組10只，所有大鼠均按照實驗動物管理和使用指南進行飼養(yǎng)和處理，于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進食。參照文獻[3]的方法制作大鼠實驗性煙霧暴露裝置，以有機玻璃、不銹鋼絲及角鋼、玻璃板、空氣泵、壓力表、膠皮管等制成體積為1 m×0.6 m×0.5 m 的熏箱，并連接體積為0.3 m×0.2 m×0.25 m的吸煙小室。煙霧暴露時將大鼠放入玻璃熏箱內(nèi)，點燃的香煙煙霧由吸煙小室導入，熏煙時艙內(nèi)氧濃度保持在21%。大鼠每周熏煙6 d，每天上、下午各1 次，每次15 支，每支香煙點燃15 min后換煙。每次點燃2支香煙放入，對照組大鼠不予熏煙。本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2.2 平均右心室收縮壓 (mean right ventricular systolic pressure，mRVSP)測定 各組大鼠于實驗終點分別為：S1m 組、S2m 組、S3m組以25%的烏拉坦 (4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于解剖臺，切開右頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及肌層，暴露右頸外靜脈，右頸外靜脈斜切口，將與壓力感受器連接并充滿肝素鹽水的PV-1肺動脈插管插入右頸外靜脈，通過壓力換能器與多導生理記錄儀相連。插入時保持導管的弧形向下，當插管插入3～4 cm 時，將插管左旋并向前推進，并密切觀察生理記錄儀圖形。當壓力上升并出現(xiàn)右心室波形時，立即固定導管并描記該波形，則測得m RVSP。

1.2.3 動脈血氣分析 測壓完畢后，腹主動脈采血2 ml，2 h內(nèi)采用全自動血氣分析儀行PaO2測定。

1.2.4 透射電鏡標本制備 取新鮮肺組織(1 mm×1 mm×1 mm)立即固定于預冷的3%戊二醛溶液，再用1%鋨酸后固定，梯度脫水后用環(huán)氧樹脂861包埋。半薄切片定位肺腺泡內(nèi)肌型動脈后，再行超薄切片，用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色后在JEM-100CXⅡ型透射電鏡下觀察肺腺泡內(nèi)肌型動脈內(nèi)皮細胞，彈性纖維及平滑肌細胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 肺組織病理學觀察和圖像分析 石蠟切片常規(guī)做HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理學變化。采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行肺小動脈管壁面積/管總面積 (wall area，WA%)的測量。選取直徑為100～200μm 的5支肺小動脈測量并記錄WA%。

1.2.6 α-SMA 免疫組織化學染色 采用鏈酶親和素-過氧化物酶法，一抗為小鼠α-SMA 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，1∶100)。用PBS替代一抗作為陰性對照。石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波修復抗原；用5%牛血清白蛋白封閉非特異性位點，依次滴加α-SMA、生物素化羊抗小鼠IgG、SABC 試劑，3,3,-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，陽性表達為胞漿內(nèi)有棕黃色顆狀著色。隨機選取5支肺小動脈直徑100～200μm 的肺小動脈，測量平滑肌細胞平均吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s 表示，各組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗分析。相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)分析法。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺小動脈管腔正常，管壁及其周圍無炎性細胞浸潤。S2m 組和S3m 組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄，有不同程度的斷裂，肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄，周圍均出現(xiàn)淋巴細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，以S3m 組為著。

2.2 煙霧暴露各組PaO2與m RVSP變化 C 組、S1m、S2m 及S3m 組PaO2分別為 (96.2±4.3)mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)、 (92.1±5.2)mm Hg、 (90.5±4.1)mm Hg、 (89.6±4.8)mm Hg，各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(F =2.004，P ＞0.05)，見表1。各組大鼠m RVSP 檢測結(jié)果分別為C 組 (14.07±4.18)mm Hg，S1m 組 (16.85±1.26)mm Hg，S2m 組(23.57 ± 4.51) mm Hg，S3m 組 (65.63 ±5.6)mm Hg，S3m 組大鼠mRVSP較C 組及S1m組升高，差異有統(tǒng)計學意義 (F =10.100，P ＜0.01，表1)。

2.3 煙霧暴露各組肺動脈超微結(jié)構(gòu)觀察 C 組內(nèi)皮細胞扁平，小動脈內(nèi)彈力膜規(guī)則，平滑肌細胞無扭曲變形，膠原纖維排列整齊。S1m 組肺小動脈內(nèi)皮細胞形狀不規(guī)則，內(nèi)膜增厚，細胞內(nèi)可見線粒體腫脹，彈力纖維增生，平滑肌細胞輕度增生。S2m 組內(nèi)彈力膜厚薄不均，部分斷裂，結(jié)構(gòu)不清；平滑肌走向不規(guī)則，膠原纖維增生。S3m 組肺小動脈結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細胞嚴重變形，胞內(nèi)線粒體損傷明顯，腫脹、減少甚至消失，細胞器模糊不清。內(nèi)膜增厚更為明顯，膠原纖維大量增生(圖1)。

2.4 肺血管形態(tài)及WA%分析結(jié)果 C 組大鼠肺動脈壁薄，煙霧暴露各組隨煙霧暴露時間延長，肺動脈壁逐漸增厚。WA%呈時間依賴性增加，煙霧暴露各組WA%與C 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均＜0.01)；煙霧暴露各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義 (F =251.690，P ＜0.01，表1，圖2)。

2.5 肺小動脈α-SMA 的表達 C組血管壁僅見少許α-SMA 表達，隨煙霧暴露時間延長，肺動脈壁α-SMA 表達量呈時間依賴性增加，煙霧暴露各組與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=23.100，P ＜0.01)；煙霧暴露各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均＜0.01，表1，圖3)。

2.6 相關(guān)分析Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示 肺血管WA%與α-SMA表達呈正相關(guān)(r=0.703，P ＜0.05)；肺血管WA%與m RVSP 無相關(guān)性(r=0.379，P ＞0.05)。

表1 各組大鼠PaO2、m RVSP、α-SMA、WA%比較 (±s)

表1 各組大鼠PaO2、m RVSP、α-SMA、WA%比較 (±s)

注：1 mm Hg=0.133 k Pa；m RVSP 為平均右心室收縮壓；α-SMA 為α-平滑肌肌動蛋白；WA%為管壁面積占血管總面積的百分比；與對照組比較，a P ＜0.01；與煙霧暴露1個月組比較，b P ＜0.01；與煙霧暴露2個月組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)PaO2 (mm Hg)m RVSP (mm Hg)α-SMA (A 值)WA% (%)對照組10 96.2±4.3 14.07±4.18 37.5±7.5 30.1±4.1煙霧暴露1個月組10 92.1±5.2 16.85±1.26 52.6±14.3a 41.2±6.3a煙霧暴露2個月組10 90.5±4.1 23.57±14.51 72.2±13.6ab 52.0±7.1ab煙霧暴露3個月組10 89.6±4.8 65.63±0.93ab 98.1±15.6abc 62.1±6.9abc F 值2.004 10.100 23.100 251.690 P 值＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

圖1 各組大鼠肺小血管電鏡觀察結(jié)果 A：對照組 ×15 000；B：煙霧暴露1個月組 ×12 000；C；煙霧暴露2個月組 ×12 000；D：煙霧暴露3個月組 ×12 000

圖2 各組大鼠肺動脈HE染色結(jié)果 HE ×100 A：對照組；B：煙霧暴露1個月組；C；煙霧暴露2個月組；D：煙霧暴露3個月組

圖3 各組大鼠肺動脈α-SMA 免疫組化結(jié)果 免疫組織化學 ×400 A：對照組；B：煙霧暴露1個月組；C；煙霧暴露2個月組；D：煙霧暴露3個月組

3 討論

肺動脈高壓是一組由異源性疾病和不同發(fā)病機制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床病理生理綜合征，臨床表現(xiàn)為右心室負荷增加，活動耐力下降，嚴重者可發(fā)生心臟衰竭而死亡。肺動脈高壓的形成機制較為復雜，涉及多種因素的相互作用。血管收縮、血管重塑和血栓形成是導致肺循環(huán)血管阻力增加的主要原因[4]。肺血管重塑是肺動脈高壓的病理學基礎(chǔ)，其特點為內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌細胞增生和肥大，外膜成纖維細胞增殖和基質(zhì)蛋白合成[5]。長期煙霧暴露可以導致肺血管重塑，且早于肺氣腫的形成[6]。本研究在常氧下給予大鼠煙霧暴露，發(fā)現(xiàn)煙霧暴露3個月后右心室收縮壓明顯升高，而PaO2無下降，與Wright等[7]研究結(jié)果一致。反映了煙霧暴露所致肺動脈高壓與低氧血癥無直接關(guān)系，分析可能是香煙煙霧直接作用于肺血管系統(tǒng)而致肺血管重塑。

吸煙是一種較為嚴重的社會公共衛(wèi)生問題，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。香煙煙霧中含7 000多種化學物質(zhì)，主要有尼古丁、焦油、一氧化碳、丙烯醛、一氧化氮、氫氰酸等6種，香煙中的主要成分尼古丁及其代謝產(chǎn)物有刺激平滑肌細胞增殖的作用。缺氧不是肺動脈高壓的唯一因素，吸煙、炎癥、氧化-抗氧化失衡等均可能參與肺動脈高壓的形成[8]。本研究觀察不同煙霧暴露時間對大鼠肺血管形態(tài)的影響，結(jié)果表明，煙霧暴露各組反映肺血管重塑的客觀指標WA%均高于C 組，且隨時間延長肺血管壁增厚漸明顯，提示吸煙可致肺血管壁增厚。吸煙所致肺血管壁增厚的機制復雜，涉及血管舒縮功能失調(diào)、平滑肌增殖凋亡異常及血管重塑等多個環(huán)節(jié)[9-10]。本研究還發(fā)現(xiàn)煙霧暴露各組α-SMA 表達均高于C 組，而以S3m 組更為明顯，提示吸煙導致無肌型動脈肌化，而這可能是肺循環(huán)阻力增大、肺動脈壓升高的關(guān)鍵。

吸煙對肺血管的直接損害研究較少，煙霧暴露所致肺小血管超微結(jié)構(gòu)病變尚屬研究的薄弱環(huán)節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)與C 組相比，煙霧暴露后肺小動脈出現(xiàn)不同程度的內(nèi)皮細胞腫脹，內(nèi)彈力膜斷裂，基底膜不完整及不規(guī)則增厚，膠原纖維在內(nèi)膜下增生，中膜平滑肌細胞增生。與低氧研究結(jié)果類似但程度似有差別[11]，表明吸煙可引起肺血管重塑，使肺微循環(huán)發(fā)生障礙，增加肺血管阻力，從而促進肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展。

總之，煙霧暴露可使肺血管形態(tài)發(fā)生明顯改變，肺小動脈超微結(jié)構(gòu)異常，導致肺血管重塑，肺血流阻力增加，右心室收縮壓升高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突