朱明慧 萬(wàn)汝燕 李飛 王曉博 于洪濤 王蘭 余國(guó)營(yíng)

1河南省胸科醫(yī)院門診部/院士工作站，鄭州450003；2河南省與科技部共建細(xì)胞分化與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；3河南省肺纖維化杰出外籍科學(xué)家工作室 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；4河南省肺纖維化國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007

特發(fā)性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性進(jìn)行性肺部疾病，其特征是肺實(shí)質(zhì)中纖維化組織異常積累，肺部瘢痕形成，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降，氣體交換中斷，最終導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡[1]。IPF影響全世界約300萬(wàn)人，并且在很大程度上不受當(dāng)前可用藥物的影響，其發(fā)病率和病死率不斷增加[2]。確診后的IPF 患者的平均生存期比較短，一般為2～3年[3]。由于IPF 的發(fā)病機(jī)制尚不明了，早期的漏診率也比較高。因此，提高IPF 的早期診斷，并且盡早的采取治療手段，對(duì)于改善IPF 患者的預(yù)后具有重要意義。

外周血生物標(biāo)志物的鑒定有助于診斷、估計(jì)預(yù)后、選擇和評(píng)估治療方法以及開(kāi)發(fā)新的治療干預(yù)措施。目前也已經(jīng)研究了許多IPF 候選血液生物標(biāo)志物，包括細(xì)胞因子、趨化因子、酶、膠原相關(guān)產(chǎn)物和Ⅱ型上皮細(xì)胞產(chǎn)物，以確定它們的診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值[4]。Human Napsin-A (NASPA)是一種天冬氨酸蛋白酶，在正常的肺和腎組織中大量表達(dá)，被認(rèn)為是原發(fā)性肺腺癌的良好診斷標(biāo)記[5]。肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 A (pulmonary surfactant protein A，SP-A)和肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白D(pulmonary surfactant protein D，SP-D)由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞產(chǎn)生，屬于C型凝集素超家族的成員，在肺的先天免疫系統(tǒng)中也起著重要作用[6]。Micro RNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA 分子，可以通過(guò)靶向信使RNA (mRNA)并觸發(fā)mRNA 裂解或翻譯抑制來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究表明，某些特定的miRNA 與癌癥有關(guān)，并可以視為治療目標(biāo)[7-8]。之前我們的研究也發(fā)現(xiàn)miR-29家族因其在組織纖維化中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而具有抗纖維化的作用[7]。miR-21和miR-30家族通過(guò)控制關(guān)鍵的信號(hào)通路和相關(guān)的癌基因在不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用[9-10]，但是與IPF的關(guān)系不得而知，是否是更好的IPF 早期診斷指標(biāo)呢? 基于此，本研究主要對(duì)IPF 患者血漿中NASPA、SP-A 和SP-D，血清外泌體中hsa-miR-21-5p(人-miR-21-5p)及血清中hsa-miR-29b-3和hsa-miR-30c-5p水平進(jìn)行分析，旨在為IPF 早期診斷、治療及臨床病情的監(jiān)測(cè)提供新的理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年2月至2019年8月河南省胸科醫(yī)院呼吸科收治的50 例IPF 患者(IPF組)資料進(jìn)行回顧性研究，其中男40例，女10例，年齡(63.06±8.46)歲，年齡范圍為48～83歲。納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)符合 《ATS/ERS/JRS/ALAT 官方聲明：IPF 診斷和管理指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；(2)無(wú)精神疾?。?(3)無(wú)心肺、自身免疫性疾?。?(4)依從性比較強(qiáng)，能夠積極配合的患者；(5)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他嚴(yán)重器官疾病者；(2)長(zhǎng)期使用激素類藥物疾病者；(3)伴有其他肺部感染的患者；(4)拒絕本次實(shí)驗(yàn)研究者。同時(shí)選取來(lái)河南省胸科醫(yī)院體檢的健康者20名為對(duì)照組，其中男15名，女5名，年齡(54.53±2.86)歲，年齡范圍為50～80 歲。與IPF組在性別、年齡分布等基本情況上，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。本研究已獲得河南省胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn) (2015-07-001)，且所有參與研究的患者和健康者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器與試劑 PCR 儀C1000 Touch及定量PCR 儀CFX96 (美國(guó)Bio-Rad公司)；潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)；紫外分光光度計(jì)K5500 (北京凱奧公司)。NAPSA (CSB-EL015452 HU)、SP-A (CSB-E08683h)及SP-D (ab213827)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒 (廣州市銳博生物科技有限公司)，RT 引物，上游引物，mimic，小RNA熒光定量PCR 啟動(dòng)試劑盒及RiboTM外泌體分離試劑(廣州市銳博生物科技有限公司)；MagenTM(廣州美基生物)。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本采集 收集IPF患者和健康體檢者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周血7 ml，3 000 r/min，離心10 min，離心半徑為12.4 cm，分離血清和血漿，-80 ℃冰箱保存，待測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)方法 應(yīng)用ELISA 檢測(cè)血漿中NAPSA、SP-A 和SP-D 水平，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。外泌體hsa-miR-21-5p、血清hsa-miR-29b-3 和hsa-miR-30c-5p 表達(dá)采用Trizol法和Magzol試劑，提取IPF 患者和對(duì)照組血清中的總RNA，適當(dāng)稀釋后利用紫外分光光度計(jì)K5500進(jìn)行濃度和OD 值的測(cè)定。反轉(zhuǎn)錄后使用Bulge-LoopTMmiRNA q RT-PCR Starter Kit并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行q RT-PCR 反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PRISM 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析，結(jié)果以±s 表示，各項(xiàng)指標(biāo)組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IPF患者的生存率 從確診為IPF時(shí)日算起，隨訪時(shí)間截至2019年8月6日，對(duì)所有患者的生存率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示大多數(shù)IPF 患者的生存期為2～3年。見(jiàn)圖1。

圖1 IPF患者的存活率統(tǒng)計(jì)圖

2.2 2 組間NAPSA、SP-A 和SP-D 水平的比較 IPF患者血漿中NAPSA 和SP-D 水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.35、2.61，P 值均＜0.05)。然而，IPF 患者血漿中SP-A水平卻明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.42，P ＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 IPF 組與對(duì)照組外泌體has-miR-21-5p 的表達(dá)量比較 由于血液樣本處理時(shí)，血小板凝血過(guò)程中會(huì)分泌大量的外泌體到血清中。為了更加精確的檢測(cè)IPF患者與健康對(duì)照組外泌體中miRNA 的表達(dá)情況，我們檢測(cè)了血漿中外泌體has-miR-21-5p的表達(dá)變化。結(jié)果顯示IPF患者血漿中外泌體hasmiR-21-5p的表達(dá)量(7.913±0.980)明顯高于對(duì)照組(1.138±0.143)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.347，P ＜0.001)。

表1 2組血漿中NASPA、SP-A 和SP-D 的水平比較 (±s)

表1 2組血漿中NASPA、SP-A 和SP-D 的水平比較 (±s)

注：NASPA 為Human Napsin-A；SP-A 為肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A；SP-D為肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白D；IPF 為特發(fā)性肺纖維化

組別例數(shù)NASPA(μg/L)SP-A(ng/L)SP-D(ng/L)IPF組50 564.5±72.0 7 754.0±646.4 75 114.0±13 061.0對(duì)照組20 290.4±37.6 90 029.0±20 986.0 14 751.0±5 242.0 t 值2.35 6.42 2.61 P 值＜0.05＜0.001＜0.05

2.4 IPF 組與對(duì)照組血清中hsa-miR-29b-3p 和hsa-miR-30c-5p的表達(dá)量比較 IPF 患者血清中hsa-miR-29b-3p的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.838，P ＜0.01)。IPF 患者血清中hsa-miR-30c-5p 的表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=0.841，P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組血清中hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-30c-5p的表達(dá)量比較 (±s)

表2 2組血清中hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-30c-5p的表達(dá)量比較 (±s)

注：IPF為特發(fā)性肺纖維化

組別例數(shù)hsa-miR-29b-3p hsa-miR-30c-5p IPF組50 0.681±0.086 1.328±0.153對(duì)照組20 1.135±0.134 1.114±0.123 t值2.838 0.841 P 值＜0.01 0.403

3 討論

IPF是一種病因不明的進(jìn)行性纖維化肺部疾病。臨床上通常采用高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)、手術(shù)肺活檢和支氣管鏡檢查等方法對(duì)IPF 病情進(jìn)行診斷和評(píng)估。其中肺部高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)是最受信任的的方法，也無(wú)法始終準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)IPF中疾病活動(dòng)的性質(zhì)。肺活檢又存在有潛在的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)際操作率較低，且增加了診斷的難度。因此，使用具有診斷和預(yù)后作用的非侵入性生物標(biāo)志物在IPF 的臨床診斷中顯得尤為重要，尤其是在醫(yī)療資源有限的情況下，它有助于識(shí)別易感患者[12]。

NASPA 是一種相對(duì)分子質(zhì)量接近38 000的天冬氨酸蛋白酶，主要表達(dá)于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，在肺泡巨噬細(xì)胞和腎小管中也有少量表達(dá)。它參與了疏水性SP-B 和SP-C 前體蛋白的水解過(guò)程，并起到誘導(dǎo)蛋白前體成熟、維持肺的正常功能和形態(tài)的作用[4，13]。本研究結(jié)果顯示，IPF 患者血漿中NASPA 表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P ＜0.05)。這可能是由于IPF患者Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生和/或上皮屏障完整性破壞所引起的。

SP-A 和SP-D 由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞產(chǎn)生，是疏水性的、含膠原的鈣依賴性凝集素，在肺和心肺部位具有一系列非特異性免疫功能。SP-D 在維持肺表面張力方面很重要，并參與肺實(shí)質(zhì)的組織、穩(wěn)定和代謝[14]。故而，SP-D 蛋白在IPF的發(fā)展中具有重要作用。本研究使用ELISA法檢測(cè)SP-D 的水平，其數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)IPF患者血漿中SP-D的水平顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)。這些結(jié)果也與之前的一些研究類似[15-16]，進(jìn)一步支持了SP-D 是公認(rèn)的IPF 標(biāo)志物這一結(jié)論。我們推測(cè)IPF患者的SP-D 升高可能是由于肺泡腔的血管滲漏增多，而這可能是由于肺泡上皮細(xì)胞的脫離，基底膜損傷和毛細(xì)血管脆性改變引起的。而SP-A 在IPF 患者中的水平明顯低于對(duì)照組，這與先前的一些研究結(jié)果不一致。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于環(huán)境的影響，不同地區(qū)的患者之間的差異所造成的。由此看來(lái)，SP-A 并不適合作為IPF肺部疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。

miRNA 是一類長(zhǎng)度約為22 nt 的內(nèi)源性RNA，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼RNA 的表達(dá)和功能。大量證據(jù)表明miRNA 通過(guò)靶向m RNA 促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、血管生成和免疫逃逸，由此可以看出它們是細(xì)胞的關(guān)鍵分子成分。由于miRNA 可在組織和體液樣本中穩(wěn)定存在，并能被分離出來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。臨床上通過(guò)抽血檢測(cè)一些物質(zhì)的改變從而指示患者的健康情況是一種可以減輕患者痛苦的微創(chuàng)方法。因此檢測(cè)IPF患者外周血中miRNA 的含量可以作為一種比較好的檢測(cè)手段[17-18]。之前的研究報(bào)道肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)miRNA-21-5p基因可明顯降低肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率，上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)。這表明miRNA-21-5p可有效拮抗肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡[19]。此外，有文獻(xiàn)表明miR-21參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β介導(dǎo)的腎纖維化，并且其水平與纖維化程度呈正相關(guān)[20]。在本研究中，qRT-PCR 結(jié)果顯示IPF患者中hsa-miR-21-5p的表達(dá)水平顯示高于對(duì)照組 (P ＜0.001)。說(shuō)明IPF患者可能通過(guò)上調(diào)hsa-miR-21-5p的表達(dá)從而減少肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)肺纖維化。有文獻(xiàn)顯示在肺成纖維細(xì)胞中miR-29b可以通過(guò)下調(diào)PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)逆轉(zhuǎn)纖維化表型[21]。在本研究中IPF 患者中hsamiR-29b-3的表達(dá)水平顯示低于對(duì)照組 (P ＜0.001)，這與我們之前的研究結(jié)果一致[7]，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于IPF 患者中減少的hsamiR-29b-3會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白的過(guò)量生產(chǎn)以及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因和重塑基因的上調(diào)。

綜上所述，我們的結(jié)果進(jìn)一步支持了SP-D 可以作為IPF 肺部疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物的結(jié)論。此外，可以將IPF患者血漿中NASPA、外泌體hsa-miR-21-5p、血清中hsa-miR-29b-3作為IPF肺部疾病診斷的候選標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突