汪方園，孫 巖，張 維，武 杰，銀廣悅

(河北中石油中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北廊坊 065000)

癌癥是由漸進(jìn)性的基因組畸變產(chǎn)生的，最終賦予癌細(xì)胞瘋狂生長的優(yōu)勢[1-2]。多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，MM約占血液惡性腫瘤的10%，隨著老齡化加重，MM發(fā)病人數(shù)逐漸增加[3-4]。腫瘤細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)機(jī)制的改變可能與疾病的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)[5]。DNA連接酶Ⅲ(LIG3)基因編碼多種DNA連接酶亞型，細(xì)菌特異性LIG3可變剪接機(jī)制生成LIG3 β參與減數(shù)分裂重組和(或)單倍體精子中DNA的修復(fù)，體內(nèi)和體外的試驗(yàn)已證明，敲除LIG3會影響MM細(xì)胞的生存能力，可見腫瘤細(xì)胞依賴于LIG3-driven修復(fù)[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)參與了骨髓瘤細(xì)胞生長和生存的調(diào)節(jié)作用[7]，主要在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)，很可能是一類潛在的癌基因[8-9]或抑癌基因[10]。

miRNA在MM中研究的文獻(xiàn)報道甚少。本研究探討miR-22、miR-156在MM發(fā)生、發(fā)展中可能的調(diào)控作用及臨床意義，為發(fā)現(xiàn)新的MM預(yù)后指標(biāo)及進(jìn)一步研究miRNA在MM發(fā)病機(jī)制中的作用打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 征集2017年9月至2019年4月經(jīng)本院血液內(nèi)科診斷及治療并自愿參試的MM患者105例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)常規(guī)檢查、骨髓細(xì)胞學(xué)檢查、骨ECT、骨髓象分析等確診為MM；(2)首發(fā)患者；(3)年齡超過65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不全；(2)合并其他腫瘤患者或自身免疫疾病或重要器官衰竭患者；(3)接受過放化療患者。依據(jù)歐洲骨髓移植協(xié)作組標(biāo)準(zhǔn)，將MM患者分為：完全緩解(血液、尿液的免疫固定電泳M蛋白為陰性，漿細(xì)胞水平<5%，發(fā)生溶骨性病變的數(shù)目和大小沒有繼續(xù)增加，細(xì)胞瘤消失)、接近完全緩解(免疫固定電泳可檢測到M蛋白，其余指標(biāo)同完全緩解)、部分緩解(血清中M蛋白減少>50%，24 h尿輕鏈降至200 mg，軟組織漿細(xì)胞瘤大小減少幅度>50%，發(fā)生溶骨性病變的數(shù)量和大小沒有繼續(xù)增加)、微小緩解(血清M蛋白水平減少25%～49%，24 h尿輕鏈水平大于200 mg)、無變化(介于微小緩解與病情進(jìn)展之間)及病情進(jìn)展(血、尿M蛋白水平上升幅度>25%)。MM患者根據(jù)治療情況分為3組：初治組(32例，男15例，女17例，年齡65～72歲)、難治組(43例，包括微小緩解、無變化及病情進(jìn)展的患者，其中男21例，女22例，年齡65～72歲)、緩解組(30例，包括完全緩解、接近完全緩解、部分緩解的患者，其中男16例，女14例，年齡65～72歲)。同時，征集門診診斷為非惡性血液病患者30例作為對照組，其中男13例，女17例，年齡65～72歲。對照組排除：急、慢性白血病患者，MM患者，巨球蛋白血癥患者，淋巴瘤患者，骨髓增生性疾病患者(骨髓增生異常綜合征、原發(fā)性血小板增多癥、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性骨髓纖維化癥)。4組患者性別、年齡對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究參照張之南等[11]主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第三版)判定療效。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自開根生化科技(北京)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自江蘇科晶公司，實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)儀購自北京科宇科技公司，cDNA合成試劑盒購自ThermoFisher公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞總RNA提取及cDNA的合成 收取以上各組患者的骨髓液，參照天根試劑盒中方法步驟提取總的RNA，參照ThermoFisher公司cDNA合成試劑盒中的方法將miRNA和mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA后凍存，用于檢測miR-22(F：GGCTGAGCCGCAGTAGTTCT；R：GTGCAGGGTCCGAGGT)和miR-156(F：TTACCGTGCTCACTCTCTT；R：GTGCAGGGTCCGAGGT)及LIG3的表達(dá)水平。

1.3.2miRNA定量引物的設(shè)計 miRNAs序列較短，大約有22個bp，miRNA的前體往往會有一段頸環(huán)結(jié)構(gòu)，其序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC[12]，可以根據(jù)這一結(jié)構(gòu)將miRNA反轉(zhuǎn)成cDNA，在qPCR檢測miRNA時，上游引物為miR序列，下游引物互補(bǔ)環(huán)部序列，可以通用。表達(dá)內(nèi)參用U6RNA，內(nèi)參檢測引物序列如下，F(xiàn)：CTCGCTTCGGCAGCACA；R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.3定量分析 參照qPCR試劑盒說明書完成qPCR體系的配置，體系如下：2 μL的miRNA第一鏈cDNA，25 μL的2×miRNA qPCR premix，濃度為10 mol/L的正向引物、反向引物分別加入5 μL，利用RNase-Free Water補(bǔ)齊到50 μL，在qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和熒光信號檢測。根據(jù)反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線和溶解曲線來判斷反應(yīng)質(zhì)量，用2—ΔΔCt法計算miR-22，miR-156的表達(dá)水平，Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時所需的循環(huán)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.4蛋白免疫印跡(Western blot) 利用Western blot技術(shù)檢測各組患者骨髓中LIG3蛋白水平。

1.3.5熒光素酶報告基因檢測 LIG3原始啟動子(WT)和突變啟動子(MT)與雙熒光素酶鏈接，再將這兩種質(zhì)粒分別與miR-22和miR-NC(陰性對照)共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，每組設(shè)15個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)的說明書進(jìn)行雙熒光素酶的檢測。按照如下計算公式計算標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活性：標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活性=螢火蟲熒光值/海腎熒光值。

2 結(jié) 果

2.14組miR-22、miR-156表達(dá)水平比較 對照組、初治組、難治組、緩解組的miR-22表達(dá)水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-156表達(dá)水平比較，初治組、難治組與對照組，難治組、緩解組與初治組，緩解組與難治組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而緩解組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組miR-22、miR-156表達(dá)水平比較

2.24組患者骨髓液細(xì)胞中LIG3的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 MM患者中LIG3 mRNA的表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，難治組中LIG3 mRNA(2.60±0.28)及蛋白表達(dá)水平在4組患者中最高。見圖1。

注：A為4組細(xì)胞中LIG3 mRNA的表達(dá)水平；B為4組細(xì)胞中LIG3蛋白表達(dá)水平。

2.3LIG3 mRNA、miR-22、miR-156的表達(dá)水平與MM臨床病理特征的相關(guān)性分析 MM患者骨髓中LIG3 mRNA、miR-22、miR-156的表達(dá)水平與病理分級有相關(guān)性(P<0.05)，LIG3 mRNA的表達(dá)水平與MM病理分級呈正相關(guān)，miR-22、miR-156表達(dá)水平與MM病理分級呈負(fù)相關(guān)，而LIG3 mRNA、miR-22、miR-156表達(dá)水平與性別、年齡無相關(guān)性。見表2。

2.4miR-22、miR-156表達(dá)水平與LIG3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 miR-22的表達(dá)水平與LIG3 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miR-156的表達(dá)水平與LIG3 mRNA的表達(dá)水平無相關(guān)性。見圖2。

2.5miR-22表達(dá)水平對LIG3轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用體外熒光素酶分析系統(tǒng)分析miR-22表達(dá)水平對LIG3轉(zhuǎn)錄水平的影響可見，在正常LIG3的啟動子中，miR-22抑制了LIG3的表達(dá)；但是將LIG3啟動子突變后，miR-22對LIG3的表達(dá)沒有影響。見圖3。

表2 LIG3、miR-22、miR-156的表達(dá)水平與MM臨床病理特征的相關(guān)性

注：A為miR-22與LIG3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性；B為miR-156與LIG3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。

圖3 miR-22對LIG3轉(zhuǎn)錄的影響

3 討 論

MM的發(fā)病率為10%～15%，屬于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤[13]，目前對其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知較少，認(rèn)為遺傳學(xué)改變和細(xì)胞因子會引起MM的發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞有一個很明顯的特征，深部基因組不穩(wěn)定，這一點(diǎn)會造成惡性漿細(xì)胞的異常增殖[14]?；蚪M的不穩(wěn)定會導(dǎo)致DNA受損，所以癌細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)機(jī)制非常重要，DNA損傷修復(fù)機(jī)制的改變可能與疾病的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。本研究考察了患者的臨床病理特征，檢測了患者體內(nèi)LIG3 mRNA及蛋白的表達(dá)量，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，LIG3在高度惡性的患者體內(nèi)表達(dá)水平最高，說明LIG3的蛋白水平是由mRNA決定的，同時LIG3的表達(dá)水平與病情有一定的相關(guān)性。LIG3可以作為一個判定MM病理情況的一個指標(biāo)。

miRNA是一種基因組編碼長度約20～23個核苷酸的非編碼mRNA，在生物體內(nèi)不編碼蛋白，它有多種靶基因，參與了基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，可能是骨髓瘤的致病因子。生物體內(nèi)的miRNA具有多種負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的作用，與靶基因的mRNA的3′端(非編碼區(qū))UTR區(qū)不完全配對，改變了mRNA的表達(dá)水平[15]。miRNA參與了細(xì)胞生長發(fā)育不同階段的時序調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和代謝等多方面。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA和腫瘤的發(fā)生有一定的相關(guān)性[8]，已有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的miR-21水平與乳癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]，說明miRNA的表達(dá)量與生物體癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞中，抑制了miR-22的表達(dá)量，從而促進(jìn)LIG3的表達(dá)翻譯，保證了MM細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，有利于其分裂生長。MM組織中miR-22、miR-156的表達(dá)量與病理分級呈負(fù)相關(guān)，而miR-22能夠結(jié)合LIG3的啟動子降低LIG3的表達(dá)；低表達(dá)量的miR-22確保了骨髓瘤細(xì)胞中LIG3的表達(dá)量，有利于MM的增殖。由此可見，miR-22能夠結(jié)合LIG3的啟動子調(diào)控LIG3的轉(zhuǎn)錄，從而影響骨髓瘤的發(fā)展。

4 結(jié) 論

miR-22、miR-156的低表達(dá)和MM的發(fā)生有關(guān)。miR-22通過調(diào)控LIG3的表達(dá)影響骨髓瘤的增殖，而miR156與LIG3之間沒有相關(guān)性，它可能通過調(diào)控其他因子影響骨髓瘤的增殖。本研究對miRNA在MM中的作用機(jī)制研究尚不夠深入，但miR-22有可能作為治療MM的靶標(biāo)基因在臨床上應(yīng)用。