劉紅偉,安冀坤,陳 麗,劉 燕,劉艷靜

(華北石油管理局總醫(yī)院：1.兒科；2.皮膚科；3.營養(yǎng)科；4.護理部，河北滄州 062552)

膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展與免疫功能紊亂、異常炎性反應及凝血功能障礙密切關(guān)聯(lián)，可引起心、肺、腎等器官衰竭甚至膿毒性休克，最終危及生命[1-2]。 特別是兒童患者，由于膿毒癥早期缺乏特異性病癥，易延誤治療，因此在常規(guī)抗感染、液體復蘇治療基礎(chǔ)上進行抗凝血治療以改善患兒凝血和免疫功能至關(guān)重要[3]。肝素鈣作為常用的抗凝血藥物，可有效改善膿毒癥患兒凝血功能，但是對于患兒的抗炎作用療效并不明確。重組人活化蛋白C(rhAPC)是一種絲氨酸蛋白酶，可通過調(diào)控絲氨酸蛋白激酶活化通路、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶水平等抑制血栓素形成，發(fā)揮抗炎作用[4-5]。Toll樣受體3(TLR3)是病原體感染機體后宿主單個核細胞通過免疫結(jié)合產(chǎn)生的TLR，其可識別患兒體內(nèi)病原體，從而通過調(diào)控下游信號通路啟動炎性反應，調(diào)控基因表達及激活氧化應激反應；而可溶性E選擇素(sE-選擇素)可介導中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞，導致患兒血管內(nèi)皮細胞損傷從而調(diào)控炎性反應，二者水平均可作為膿毒癥進展的評價指標[6-7]。因此，本文將以凝血功能及TLR3、sE-選擇素等為評價指標，進一步探討那屈肝素鈣聯(lián)合rhAPC治療兒童膿毒癥的療效，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究對象為2016年6月至2019年12月于本院收治的200例膿毒癥兒童，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組A、B、C，每組各50例，年齡3～15歲。4組患兒性別、年齡、小兒危重病例評分(PCIS)等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。納入標準：(1)符合Sepsis3.0中的關(guān)于膿毒癥的診斷標準[8]；(2)中華醫(yī)學會兒科學分會制定的PCIS均超過65分。排除標準：(1)存在嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙者，有血液、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(2)發(fā)病前接受免疫抑制劑治療者；(3)對低分子肝素、rhAPC過敏，依從性、耐受性差?；純喝虢M前均由家屬簽署知情同意書，且該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2治療方法 對照組患兒采用常規(guī)抗感染治療，并在治療期間適時地補充營養(yǎng)以糾正水電解質(zhì)紊亂和維持患兒體內(nèi)酸堿平衡，具體給藥方式如下：靜脈滴注平衡液(晶體/膠體=2/1)，劑量為20～30 mL/kg，速度為99 mL/h。維持患兒中心靜脈壓在8～12 mm Hg，若患兒收縮壓偏低(≤90 mm Hg)，則可添加去甲腎上腺素或者多巴胺，直到收縮壓不低于90 mm Hg，若患兒清除率(Cl)低于41.7 mL/min，則可添加巴酚丁胺。觀察組A患兒在對照組的基礎(chǔ)上靜脈注射rhAPC(廠家：美國Biotic公司；批號：jt-w0738)，2 500 U溶于生理鹽水(每毫升注射液中含有25 mg人血清清蛋白，5 mg 甘氨酸，5.9 mg枸櫞酸鈉)，連續(xù)靜脈注射給藥96 h，24 μg/ (kg·h)。觀察組B患兒在對照組基礎(chǔ)上皮下注射那屈肝素鈣(廠家：Sanofi Winthrop Industrie；規(guī)格：0.4 mL，4 100 AXaIU；國藥準字J20040118)，每次0.4 mL，12 h 1次，7 d為1個療程。觀察組C在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用那屈肝素鈣、rhAPC，給藥方式分別同觀察組A、B。3組患兒均持續(xù)治療1個療程，在整個治療過程中醫(yī)護人員需密切關(guān)注患兒的血壓、體溫、心率等臨床體征。

表1 4組患兒一般資料比較

1.3觀測指標

1.3.1臨床療效 治療7 d后評估臨床療效。(1)體溫穩(wěn)定在36～38 ℃；(2)心率恢復至正常水平；(3)呼吸頻率小于20次/分；(4)白細胞計數(shù)(4～12)×109/L。上述指標至少符合3項則被判斷為有效[9]，治療有效率=有效例數(shù)/總例數(shù)。統(tǒng)計分析患兒住院時間及治療7 d后的PCIS。

1.3.2血氣指標 治療7 d后測量患動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、血氧飽和度(SaO2)水平。

1.3.3T細胞亞群指標、TLR3及sE-選擇素水平 在治療前和治療7 d后早晨抽取患兒空腹外周靜脈血約3 mL×3份，其中2份用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑處理得抗凝全血，1份以淋巴細胞分離液處理，獲取外周血單核細胞(PBMC)，應用流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)計數(shù)外周血T細胞亞群指標(CD3+、CD4+、CD8+)水平，并計算其占淋巴細胞的百分數(shù)；另1份使用單個核細胞分離液得到單個核細胞，經(jīng)固定、破膜及上樣處理后應用流式細胞儀測定TLR3表達水平，熒光染色的TLR3陽性細胞所占總體細胞的百分比即為TLR3的表達陽性率。第3份于4 000 r/min離心10 min(半徑10 cm)，上清液置入EP管中并保存于-70 ℃待檢。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測EP管中血清sE-選擇素水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.4凝血功能指標 分別在治療前及治療7 d后采用凝血分析儀(廠家：德國BE股份有限公司；型號：Thrombolyzer XRM型)測定患兒血小板計數(shù)(PLT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原(Fib)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、D-二聚體(D-D)水平。

1.3.5不良反應 觀察并記錄患兒治療過程中用藥反應。

2 結(jié) 果

2.1臨床療效比較 治療后觀察組C的有效率高于其他3組(P<0.05)，觀察組A、B有效率接近，對照組最低；觀察組C病死率最低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2血氣指標比較 與治療前相比，治療7 d后4組患兒PaO2、SaO2水平增加，而PaCO2水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中觀察組C治療效果最好，血氣指標優(yōu)于其他3組(P<0.05)，觀察組A、B療效相近，但優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3自然殺傷細胞(NK細胞)百分率比較 與治療前相比，治療后4組患兒外周血NK細胞亞群各水平均有所改善，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低，其中觀察組C改善效果最佳(P<0.05)。見表4。

表2 4組患兒臨床療效對比[ n(%)]

2.4凝血功能指標比較 與治療前比較，治療7 d后4組患兒的 PT、PLT、 APTT、TT、 Fib、D-D水平均有改善，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，且觀察組C改善最佳(P<0.05)。見表5。

2.5TLR3、sE-選擇素水平比較 與治療前比較，治療7 d后4組患兒的TLR3、sE-選擇素水平均降低(P<0.05)，其中觀察組A、B、C治療7 d后各水平低于對照組，以觀察組C降低程度最大(P<0.05)。見表6。

2.6PCIS比較 治療7 d后，4組患兒的PCIS均高于治療前(P<0.05)，觀察組A、B、C的PCIS高于對照組(P<0.05)，觀察組C的PCIS高于觀察組A、B (P<0.05)。見表7。

2.7住院時間比較 治療7 d后，觀察組A、B、C住院時間短于對照組，觀察組C住院時間短于觀察組A、B (P<0.05)。見表8。

2.8不良反應比較 4組患兒治療期間不良反應主要為顏面潮紅、皮疹、血性膀胱炎，不良反應均較輕，且對癥治療后均很快消失，4組患兒不良反應發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表9。

表3 4組患兒治療前后血氣指標比較

表4 4組患兒外周血NK細胞水平比較

表5 4組患兒凝血功能指標比較

組別nFib(g/L)治療前治療7 d后TT(s)治療前治療7 d后D-D(mg/L)治療前治療7 d后觀察組A501.54±0.462.42±0.38abc28.56±4.7617.37±2.501abc1.85 ± 0.410.76± 0.22abc觀察組B501.49±0.512.35±0.43abc27.48±4.4118.76±3.02abc1.81 ± 0.370.98± 0.28abc觀察組C501.42±0.472.72±0.45ac27.83±4.6114.30±2.75ac1.78± 0.341.02± 0.26ac對照組501.46±0.432.05±0.50c26.79±4.3520.24±3.12c1.89 ± 0.311.16± 0.24c

表6 4組患兒TLR3、sE-選擇素水平比較

表7 4組患兒PCIS比較分)

表8 4組患兒住院時間比較

表9 4組患兒不良反應比較

3 討 論

膿毒癥是一種由細菌、病毒等病原體感染而致的全身性炎癥反應綜合征，病原菌入侵后刺激機體產(chǎn)生大量促炎癥介質(zhì)，進而刺激機體產(chǎn)生大量炎癥因子，導致免疫異常，凝血系統(tǒng)紊亂，最終引起多系統(tǒng)、器官病理學改變，是引起重癥監(jiān)護病房患兒死亡的重要原因[10]。目前膿毒癥的常規(guī)治療在于改善臨床病癥(發(fā)熱、營養(yǎng)失調(diào)、電解質(zhì)紊亂等)，并配合抗感染、抗血栓治療等。由于膿毒癥是多種促凝血因子、炎癥介質(zhì)引起的全身性的炎性反應，常規(guī)治療方案療效有限，因此在常規(guī)治療基礎(chǔ)上采用強效炎性因子抑制劑可有效改善炎性反應對機體的侵襲，從而調(diào)控凝血功能，降低炎性反應對重要臟器的損傷，進而有利于預后。rhAPC作為一種人工合成的蛋白C類似物，其可通過活化內(nèi)皮細胞蛋白C受體、血栓調(diào)節(jié)蛋白從而激活磷酸鞘氨醇、PAR-1，發(fā)揮抗炎、抗凝血等功效[11]。本研究結(jié)果顯示，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合肝素的抗凝治療，以及rhAPC的抗炎治療，能迅速改善患兒臨床癥狀，有效改善患兒血氣指標及PCIS，提高治療有效率，降低病死率，縮短住院時間。整個治療過程中盡管4組患兒均存在一定程度的不良反應(顏面潮紅、皮疹、血性膀胱炎等)，但對癥治療或者停藥后均很快消失，且4組患兒的不良反應發(fā)生率無顯著性差異，表明聯(lián)合治療安全性可靠，值得臨床推廣應用。

有研究顯示，膿毒癥患兒往往存在免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)紊亂，其中免疫系統(tǒng)中CD4+、CD8+等NK細胞表達紊亂，導致機體異常炎性反應，使得血管內(nèi)皮細胞受損，誘導促凝血因子的高表達，使各凝血指標異常，如，D-D是交聯(lián)Fib特異性的降解產(chǎn)物，其水平與病情嚴重程度呈正相關(guān)； PLT參與止血和堵塞傷口，其水平升高則會導致生物化學性的黏附聚合，各個物質(zhì)相互配合，最終誘導血凝狀態(tài)的發(fā)生[2,12-13]。因此在抗凝治療基礎(chǔ)上聯(lián)合使用rhAPC進行抗炎治療，可通過改善炎性反應和凝血功能，從而減少內(nèi)皮損傷，共同改善患兒臨床癥狀。本研究結(jié)果顯示，治療后4組患兒外周血NK細胞亞群水平及凝血功能指標較治療前均有所改善，但均以觀察組C改善效果為優(yōu)，表明在常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合使用肝素和rhAPC可有效改善患兒凝血功能和免疫功能，這與沈萍[11]報道一致。

膿毒癥患兒在發(fā)生異常炎性反應時，機體會釋放大量的炎癥介質(zhì)，同時改變機體免疫應答，如激活免疫細胞死亡程序，其中TLR作為機體病原相關(guān)分子識別受體，在患兒受到病原菌侵襲時可觸發(fā)免疫應答反應，調(diào)節(jié)患兒免疫功能， TLR3是TLR中可唯一識別病毒雙鏈RNA的受體，其水平變化可有效反映病原體感染機體后的免疫應答情況[14]。 TLR3作為免疫應答反應的上游階段，sE-選擇素則是作為免疫調(diào)控結(jié)果的中下游階段，其可介導中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞，引起內(nèi)皮細胞損傷，從而使得炎性反應加重，高表達于膿毒癥患兒血清中，因此可作為膿毒癥患兒治療效果的評價指標[15]。本研究結(jié)果顯示，治療后4組患兒的TLR3、sE-選擇素水平均降低，觀察組A、B、C低于對照組，而觀察組C降低程度最大(P<0.05)，表明在常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合使用肝素和rhAPC可有效降低TLR3和血清sE-選擇素水平，從而調(diào)控機體免疫功能和改善機體炎癥異常情況，最終有利于患兒預后。分析認為，常規(guī)治療可一定程度殺死病原菌，從而降低TLR3受體的表達，進而阻斷下游免疫級聯(lián)放大效應，調(diào)控NK細胞的表達水平，即CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低。聯(lián)合使用那曲肝素鈣時，抑制Ⅶa、Ⅸa等凝血因子活性，組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、組織因子途徑抑制物增多，導致血小板聚集，降低黏附聚集、改善血流動力學狀態(tài)、減少內(nèi)皮細胞損傷等，故而治療后患兒PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，凝血功能得到改善[5]，而rhAPC則可通過凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白激活蛋白酶激活受體(PAR)-1通路，以及上調(diào)1-磷酸鞘氨醇，進一步降低機體炎性反應[11]，使sE-選擇素表達水平降低，減輕內(nèi)皮細胞損傷，故而形成循環(huán)調(diào)控體系，調(diào)控凝血功能，改善免疫功能和炎性反應，提高治療效果。

4 結(jié) 論

那屈肝素鈣聯(lián)合rhAPC治療兒童膿毒癥效果顯著，可有效改善凝血功能，調(diào)控免疫應答，從而降低血清TLR3、sE-選擇素水平，提高治療效果。