火 婷，胡 玥，高旭東，李云春，魏小寧，邵士俊

(1.中國科學院 蘭州化學物理研究所 中科院西北特色植物資源化學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000; 2.中國科學院 蘭州化學物理研究所 公共技術(shù)服務中心，甘肅 蘭州 730000)

近年來，隨著大眾健康保健意識日益增強，對保健食品的需求也與日俱增.保健食品又稱功能性食品，是一個特定的食品種類，保健食品被定義為：具有一般食品的共性，能調(diào)節(jié)人體的機能，適用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的[1-4].然而，面對高額利潤的誘惑，同時為了實現(xiàn)前期的宣傳功效，不法商販常在保健食品中非法添加具有治療效果的藥物[5-6]和有害成分，且添加成分也日趨復雜，這些現(xiàn)象都對保健食品的食用安全造成了嚴重威脅.二氫吡啶類鈣拮抗劑藥物在臨床中適用于治療各型高血壓尤其是重癥高血壓，但由于其價格便宜，成為最常見的非法添加藥物之一，被非法添加在降壓類保健產(chǎn)品中[7].西地那非、他達那非等藥物被非法加入抗疲勞保健食品中.馬來酸氯苯那敏等抗組胺類化學藥物被非法添加至保健食品的制劑中[8]，導致消費者產(chǎn)生藥物過敏.此外，還有比較常見的飲片染色[9]、非法添加物的來源不明[10-13]、劑量隨意[14]、排異性未知[15]等現(xiàn)象.若長期服用含有非法添加物的保健食品，會極大損害消費者的身心健康和經(jīng)濟利益.為打擊非法添加現(xiàn)象，規(guī)范市場秩序，國家食品藥品監(jiān)督管理局在2009年頒布了藥品補充檢驗標準[16]，并且頒布了保健食品的食品安全國家標準[1].

由于保健食品的基質(zhì)復雜、基體干擾嚴重，因此對于保健食品中微量甚至痕量非法添加物的分析而言，高效、高選擇性的樣品前處理方法和靈敏的分析手段至關(guān)重要.檢測方法的局限性導致了監(jiān)管困難，因此迫切需要建立多指標、全方位的檢測方法，包括通過色譜技術(shù)實現(xiàn)目標化合物的分離，質(zhì)譜技術(shù)進行定性確認，表面增強拉曼光譜或核磁共振波譜等技術(shù)實現(xiàn)輔助表征，為保健食品的質(zhì)量安全提供技術(shù)保障.本文通過綜述保健食品中非法添加物的各種傳統(tǒng)及新型檢測前處理和分析方法的研究現(xiàn)狀，為進一步研究建立高效簡便的前處理方法和檢測新方法、新技術(shù)提供理論參考.

1 保健食品中非法添加物的樣品前處理方法

前處理主要是指將樣品通過分解和溶解方法實現(xiàn)對待測組分的提取、純化、濃縮的過程，待測組分通過此過程轉(zhuǎn)化為可直接進行測定的形式，最終完成待測組分的定性和定量分析檢測.樣品前處理方法的簡單高效不僅可以實現(xiàn)檢測省時省力，還可以有效避免人員操作和樣品轉(zhuǎn)移過程中引入的誤差，并且減少有機試劑的使用.目前，保健食品中非法添加物常見的樣品前處理方法主要包括溶劑萃取和固相萃取(solid phase extraction, SPE)等方法.

1.1 溶劑萃取法

最常見的樣品前處理方法為溶劑萃取法.在對保健食品中非法添加物的前處理方法中，一般使用無機溶劑(水、酸、堿)或/和有機溶劑(甲醇、乙醇、二氯甲烷和混合醇等)萃取.康寧[17]等使用甲醇超聲提取樣品中5種非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素)，選用合適的洗脫液(20 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸/甲醇)進行梯度洗脫，通過飛行時間質(zhì)譜儀(time of flight mass spectrometry, TOF-MS)，采用電噴霧陽離子電離方式(ESI+)，通過多離子檢測模式(multiple reaction monitoring, MRM)進行定量.劉斌等[18]將樣品加入甲醇中超聲提取，去離子水稀釋后用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)測定.

此外，隨著研究的不斷深入，也出現(xiàn)了很多新型溶劑萃取方法，比如Cao等[19]首次通過“點擊”反應制備新型離子液體功能化聚丙烯腈納米纖維氈(IL/PAN-NFsM)，并評價了其靈敏度，建立了高通量篩選方法.制備過程中首先采用靜電紡絲法制備PAN-NFsM，它是一種納米尺度下纖維眾多的大尺度多孔材料，再通過硫醇-烯鍵反應得到SH/PAN-NFsM，隨后甲基咪唑鹽酸鹽通過“點擊”反應產(chǎn)生IL/PAN-NFsM.由于IL/PAN-NFsM良好的預分離效率，可以通過固相萃取過程在數(shù)十秒內(nèi)從復雜的樣品基體中吸附痕量目標物，然后作為直接分析實時質(zhì)譜(DART-MS)的采樣模塊，無需任何額外的處理.這意味著集中在IL/PAN-NFsM上的目標分析物被直接解吸、電離，并用DART-MS進行最終檢測.

1.2 固相萃取法(SPE)

SPE利用分離過程中的選擇性吸附與選擇性洗脫，最常用的方法是先使樣品溶液通過吸附劑，由于吸附劑具有選擇性，使待測組分保留在吸附劑上，適當比例的溶劑除雜后，通過篩選出的最佳洗脫劑將待測組分洗脫后待測，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的.譚麗容等[20]在將樣品預處理除雜后，選用C18固相萃取柱除去糖類等極性物質(zhì)，而后通過季胺固相萃取柱(SAX)，吸附和獲得帶有弱陰離子的化合物，最后經(jīng)過羧酸固相萃取柱(WCX)，吸附和獲得堿性的化合物.梯度洗脫過程中選用合適的流動相(0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈)，合并SAX和WCX小柱純化得到的洗脫液待測.采用電噴霧陽離子電離方式(ESI+)，通過MRM檢測.通過SPE聯(lián)用法對復雜樣品進行分離純化，降低基質(zhì)成分對測定的干擾，提高檢測的靈敏度.此方法大大降低溶劑用量，操作過程簡單，檢測結(jié)果準確，可用于改善陽虛和/或緩解疲勞類保健食品中非法添加物的檢測，同時也為相應的監(jiān)管機構(gòu)提供技術(shù)支持.

2 保健食品中非法添加物的分析方法

目前保健食品中非法添加物的檢測技術(shù)已取得很大進展，依靠于高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，添加物的檢出限和定量限均能滿足相關(guān)機構(gòu)的檢測要求，常見的分析檢測方法包括高效液相色譜方法(high performance liquid chromatography, HPLC)和超高效液相色譜方法(ultra performance liquid chromatography, UPLC).與普通的HPLC相比，UPLC具有靈敏度更高、分析速度更快和分辨率更強的優(yōu)點.將UPLC與不同檢測器串聯(lián)，其中串聯(lián)質(zhì)譜的選擇性及靈敏度明顯優(yōu)于串聯(lián)其它檢測器，也是現(xiàn)有分析檢測技術(shù)中效果較好的一種.而最為常見的聯(lián)用技術(shù)則包括高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(HPLC-MS)、固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, SPE-UPLC-MS/MS)、UPLC-Q-Orbitrap HRMS以及新型的常溫常壓離子化技術(shù)實時直接分析質(zhì)譜(direct analysis in real time，DART-MS)、離子遷移譜(ion mobility spectrometry，IMS)，另外還有表面增強拉曼光譜技術(shù)(surface-enhanced raman spectroscopy , SERS)、溶劑微萃取技術(shù)結(jié)合表面增強拉曼光譜法(SME-SERS)和核磁共振波譜技術(shù)(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等.

2.1 高效液相色譜技術(shù)(HPLC)

HPLC具有靈敏度高、可反復使用色譜柱和樣品易回收等特點.該技術(shù)在化學、醫(yī)學、工業(yè)和法檢等領(lǐng)域中應用廣泛，其最重要的一步為待測物在色譜中實現(xiàn)分離.Wang等[21]采用高效液相色譜多維指紋圖譜分析方法，建立了海狗人參丸中非法摻雜物的分級檢測方法，通過HPLC(二極管陣列檢測器和熒光檢測器)分析11批樣本獲得指紋圖譜，分析了Ⅴ型磷酸二酯酶抑制劑、雄激素、α受體拮抗劑和育亨賓等非法添加物，為減少和消除干擾同時突出樣本的色譜特征，在多個波長下進行分析.通過標準指紋圖譜與樣品的色譜圖譜對比，目標分析物易于識別，利用一階、二階指紋圖譜和光譜檢測相結(jié)合的方法，通過建立分層篩選策略，構(gòu)建多維指紋圖譜，利用該篩選方法避免假陽性和假陰性結(jié)果，得到了具有較高準確性和可靠性的試驗結(jié)果.該方法已成功應用于實際樣品中非法摻假物質(zhì)的篩選，并通過驗證試驗，顯示出良好的定量性能.在16批樣品中，有3個疑似樣品被確認為陽性，分別含有9.37 μg/g 睪酮、18.8 μg/g 他達那非和48.5 μg/g 西地那非.回收率為83.6%～103.1%，相對標準偏差為4.2%～6.8%.該方法簡單易操作，且與HPLC-MS相比成本較低，在檢出限以內(nèi)可作為一種檢測的替代方法.但是HPLC法只能通過保留時間定性，不能確證化合物結(jié)構(gòu)信息[22].因此，HPLC常用于保健食品中微量非法添加物的分析檢測.

2.2 超高效液相色譜法(UPLC)

與普通HPLC相比，具有1.7 μm填料的UPLC的靈敏度更高、分析速度更快、分辨率也更強[23].韓春曉等[24]采用UPLC技術(shù)實現(xiàn)了5 min內(nèi)快速檢測維生素C中非法添加地塞米松磷酸鈉，檢出限為10.0 mg/L.Huang F等[25]通過UPLC技術(shù)檢測了膠囊、片劑、酒、咖啡、糖果等300多個保健樣品中的17種壯陽類化合物，檢出頻率最高的為西地那非和他達那非，羥基硫代豪莫西地那非、去甲西地那非、硫代豪莫西地那非等成分檢出頻率較低.檢出藥物的添加量在保健酒和咖啡中分別為0.01%～0.05%和0.1%～1.0%，片劑及膠囊中的添加量為0.2%～20%.因此，UPLC常用于保健食品中痕量非法添加物的分析檢測.

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(HPLC-MS)

HPLC-MS有效結(jié)合了液相色譜的分離性能和質(zhì)譜的鑒定組分性能，實現(xiàn)了對復雜有機混合物的準確分離分析.HPLC-MS技術(shù)中電噴霧電離質(zhì)譜的質(zhì)譜圖簡單明了且數(shù)據(jù)處理簡單，該技術(shù)廣泛應用于有機分析、藥物分析、食品檢驗以及生產(chǎn)質(zhì)量控制和質(zhì)檢等方面.康寧[17]等通過HPLC-Q-TOF/MS檢測出了安神類保健食品中的5種非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素).該分析方法具有選擇性強、靈敏度高、測試時間短、操作過程簡單等優(yōu)點.檢測結(jié)果表明：5種非法添加物的質(zhì)量濃度在10～1 000 μg/L時，線性關(guān)系良好，采用該方法對6種市售保健食品(膠囊、茶、口服液)進行檢測，在其中一種膠囊中檢測出質(zhì)量分數(shù)為1.656 mg/kg的非法添加物青藤堿.HPLC-MS具有高靈敏度和高選擇性，是目前非法添加化合藥物檢測中使用廣泛的技術(shù)手段之一，但是高分辨質(zhì)譜如TOF-MS因價格昂貴，不易推廣[22].

2.4 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(SPE-UPLC-MS/MS)

譚麗容等[20]建立了SPE-UPLC-MS/MS同時測定保健品中20種改善陽虛和/或緩解疲勞類化學物質(zhì)的分析方法.其中鹽酸育亨賓和二乙氨基前他達拉非的檢測文獻報道較少，以期完善非法添加壯陽類藥物的檢測種類，并為進一步規(guī)范保健食品市場提供技術(shù)支撐.通過進一步優(yōu)化和選擇試驗條件，確定了固相萃取、色譜、質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)中各最佳條件，實現(xiàn)了5 min內(nèi)完全分離鑒定20 種非法添加物.串聯(lián)技術(shù)中通過固相萃取可實現(xiàn)對復雜樣品的純化，從而有效避免食品基質(zhì)成分對測定的干擾，使檢測靈敏度提高.20種改善陽虛或緩解疲勞類化合物在0.5～30 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，20種對照品的最低檢出限(limits of detection, LOD)均低于0.2 ng/mL，定量限(limits of quantitation, LOQ)在0.1～0.5 ng/mL 范圍.該方法操作簡單、靈敏度高、重復性好，溶劑用量少，可用于改善陽虛和/或緩解疲勞類保健食品中非法添加物的檢測，同時也為相應的監(jiān)管機構(gòu)提供技術(shù)支持.

2.5 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)

UPLC-Q-Orbitrap HRMS是四極桿質(zhì)譜和靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜串聯(lián)并與液相色譜聯(lián)用的檢測方法,在具有普通液質(zhì)檢測方法定性功能的同時兼具質(zhì)量分辨率高和篩查過程簡單的優(yōu)勢，數(shù)據(jù)掃描模式(dd-MS2)可以在篩查的同時，通過碎片離子進行定性確認，彌補了傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜在篩查和定性上的不足[26-28].劉斌等[18]通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS方法快速定量檢測保健品中常見的29種非法添加物.選用高粒徑的HSS T3(1.8 μm)色譜柱進行分離，以縮短掃描時間，每個樣品只需15.5 min，同時實現(xiàn)了快速篩查和準確定量檢測分析.質(zhì)譜分析通過全掃描/二級掃描模式，建立一級質(zhì)譜(MS)和二級質(zhì)譜(MSMS)數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)高通量篩查及定量分析.各組分中線性良好的質(zhì)量濃度范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.3～20 ng/g，回收率達68.2%～105.3%，相對標準偏差為0.4%～11.3%，對建立的方法進行方法學考察，能夠滿足日常檢測的要求.

2.6 直接分析實時質(zhì)譜(DART-MS)

新型常溫常壓離子化技術(shù)是近幾年質(zhì)譜學領(lǐng)域的一個研究熱點，其中實時直接分析(DART)近年來已被應用于不同樣品的分析.DART過程具有樣品制備極其簡單和檢測流程簡單的優(yōu)點.大大提高了質(zhì)譜儀器的易用性[29].Cao等[19]通過直接分析實時質(zhì)譜(DART-MS)進行檢測，將IL/PAN-NFsM固定在商用玻璃毛細管尖端的底部，用DART-MS進行自動直接分析.在最佳條件下，通過考察靈敏度和穩(wěn)定性，對該方法的分析性能進行了評價，驗證了該方法的可行性，在6種抗糖尿病保健茶樣品中篩查出3種非法添加的合成藥物(格列齊特、格列美脲和格列酮).試驗結(jié)果表明，靈敏度在ng/g水平，總分析時間不超過1.0 min，并提出了一種功能化的NFsM與DART-MS直接結(jié)合的新型篩選模式，有望成為食品安全分析的一種通用方法.

2.7 離子遷移譜技術(shù)(IMS)

IMS通過不同的離子漂移時間實現(xiàn)對離子的分離定性[30]，與傳統(tǒng)的質(zhì)譜、色譜法比較，IMS技術(shù)分析時間短，無溶劑和氣體的使用，靈敏度高.常用于小型、微型化方面，并具有以下優(yōu)點：(1)不需要真空系統(tǒng)，裝置較小.(2)靈敏度極高.在不加任何富集的情況下，IMS就可以達到pg量級，使其適用于現(xiàn)場在線快速分析.(3)可實現(xiàn)對同分異構(gòu)體等的區(qū)分.現(xiàn)有研究中廣泛應用于爆炸物、毒品和化學毒劑檢測等方面，在保健食品中非法添加物檢測方面的應用研究較少.Feng X等[31]通過IMS快速檢測保健食品中非法添加的7種Ⅴ型磷酸二酯酶抑制劑(西地那非、那紅地那非、他達拉非、氨基他達拉非、偽伐地那非、那莫西地那非、二乙胺他達拉非).Jiao等[32]通過IMS建立改善睡眠類保健品中非法添加物(苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥)快速檢測方法，并通過LC-MS進行了確認.

2.8 表面增強拉曼光譜技術(shù)(SERS)

拉曼光譜是表征分子的特征結(jié)構(gòu)的一種分子振動光譜.但是由于拉曼散射效應過程較弱，一般都通過某種增強效應實現(xiàn)對表面吸附物的拉曼光譜研究.張建紅等[33]建立的抗疲勞類保健品中非法添加化學藥物的檢測方法中應用了拉曼光譜技術(shù)，并對市售抽樣送檢的保健品進行測試，準確率達95%以上.吳國萍[34]等通過SERS中自制納米金表面增強試劑研究了對21種保健品樣品中的非法添加物西地那非的快速檢測，篩選出最佳配比的納米金和不同濃度的鹽酸、硝酸和硫酸作為助劑.試驗結(jié)果表明，該自制表面增強試劑可檢出西地那非的質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL.

2.9 溶劑微萃取技術(shù)結(jié)合表面增強拉曼光譜法(SME-SERS)

Li等[35]采用溶劑微萃取技術(shù)結(jié)合表面增強拉曼光譜技術(shù)，建立了一種快速、準確地檢測保健品中阿替洛爾(ATN)、鹽酸二甲雙胍(MET)、鹽酸苯甲雙胍(PHE)等非法藥物添加劑的方法.試驗結(jié)果表明，以甲醇-氯仿(體積比為1∶4)為混合萃取劑適用于非法藥物添加劑的快速微萃取分離，并能誘導氯仿表面的銀膠體分布.更重要的是，甲醇在此過程中可以攜帶藥物分子進入銀膠體的顆粒間，從而顯著提高非法藥物添加劑的檢測靈敏度，進一步減少可能的干擾，以銀膠為活性底物，通過微萃取法分離不同保健品中的非法藥物添加劑，同時便攜式拉曼光譜儀可實現(xiàn)原位檢測.

2.10 核磁共振波譜技術(shù)(NMR)

NMR是將核磁共振現(xiàn)象應用于測定分子結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)，主要研究原子核1H(氫譜)和13C(碳譜)的波譜.通過核磁共振波譜化學位移可以獲取分子中化學官能團的數(shù)目和種類等信息，在蛋白質(zhì)以及小分子化合物的結(jié)構(gòu)解析中較為常見.Hachem等[36]將1H-NMR技術(shù)應用于檢測天然減肥保健品中非法添加的化學藥物，通過LC-MS/MS驗證NMR結(jié)果，結(jié)果表明1H NMR方法可準確檢測保健食品中非法添加的化學藥物.

3 總結(jié)與展望

目前，保健食品中非法添加物檢測研究基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，其中TOF-MS和離子阱質(zhì)譜成為更加有效的分析技術(shù).隨著現(xiàn)代化儀器的飛速發(fā)展，對保健食品中化學藥物及非法添加物的檢測，甚至痕量添加物的檢測、定性定量檢測和篩查方面均取得了較大的進步，但是這些儀器具有價格昂貴且運行維護成本高的問題.隨著研究的發(fā)展，期望在前處理及分析方法領(lǐng)域取得突破.

隨著我國社會經(jīng)濟的跨越式發(fā)展，食品安全已成為關(guān)系到國計民生的重要問題，而對保健食品的安全控制現(xiàn)已納入我國現(xiàn)行的食品衛(wèi)生檢驗標準.在對保健食品實行嚴格監(jiān)管過程中，對其中非法添加物檢測的前處理方法及分析技術(shù)研究值得深入進行，建立高效、簡潔的多指標、全方位檢測方法迫在眉睫.