殷文明，蔣敬庭，吳昌平

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究院，江蘇常州213003)

食管癌患者早期癥狀不明顯，治療預(yù)后差，總體5年生存率僅為15%～25%[1]。傳統(tǒng)的影像學(xué)技術(shù)和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在食管癌的早期診斷、治療后隨訪及病情評(píng)估方面存在諸多局限。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)檢測(cè)取材方便，靈敏度高，且能實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移及評(píng)估腫瘤進(jìn)展，作為一種新型分子標(biāo)志物近年來(lái)越來(lái)越受到人們關(guān)注[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤中ctDNA檢出率高達(dá)75%[5]。本文就ctDNA在食管癌治療領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，旨為食管癌的精準(zhǔn)診療提供新策略。

1 ctDNA及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)

1.1ctDNA 健康人外周血中存在游離DNA片段(cell-freeDNA，cfDNA)，而腫瘤患者體內(nèi)的cfDNA含量明顯高于健康人群，晚期腫瘤患者體內(nèi)含量更多。這部分來(lái)源于腫瘤的cfDNA即為ctDNA。cfDNA在DNA釋放過程中保留了核染色質(zhì)的某些特征。腫瘤患者的cfDNA中含有各種與腫瘤基因突變相同的體細(xì)胞突變，如致癌基因和抑癌基因的突變、微衛(wèi)星變化、啟動(dòng)子甲基化和雜合性缺失等。

cfDNA分子大小為500～30 000 bp，而ctDNA片段長(zhǎng)度僅為150～200 bp[6]。ctDNA的半衰期在15 min至數(shù)小時(shí)不等，平均約2 h[7]。ctDNA來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的壞死及凋亡；血液循環(huán)或微轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的溶解釋放；腫瘤細(xì)胞主動(dòng)釋放DNA進(jìn)入血液循環(huán)；血液中的DNA酶抑制劑抑制血漿DNA降解，使DNA在血液中富集等。多數(shù)研究認(rèn)為，細(xì)胞的凋亡、壞死和分泌是ctDNA的主要來(lái)源。

1.2ctDNA檢測(cè)方法 外周血中ctDNA數(shù)量較少，占cfDNA總數(shù)的0.01%～1%，需用高特異性、高靈敏性方法進(jìn)行檢測(cè)。主流的檢測(cè)方法有數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(digital PCR，dPCR)、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplified refractory mutation system，ARMS)、新一代測(cè)序法(next-generation sequencing，NGS)等[8]。ARMS和dPCR法檢測(cè)靈敏度高，可絕對(duì)定量，缺點(diǎn)是僅能檢測(cè)已知突變位點(diǎn)和基因重排。NGS法可進(jìn)行全基因組的單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異檢測(cè)，基因重排和擴(kuò)增，可檢測(cè)未知突變。然而其敏感性和特異性受DNA聚合酶的錯(cuò)誤率和測(cè)序反應(yīng)的限制，并且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。

ctDNA檢測(cè)技術(shù)包含定量檢測(cè)和定性檢測(cè)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA濃度與患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷大小呈正比，通過定量檢測(cè)外周血ctDNA濃度，可根據(jù)濃度的高低來(lái)推測(cè)腫瘤情況。但凝血過程中淋巴細(xì)胞破裂釋放DNA可影響循環(huán)DNA檢出水平。定量分析時(shí)，血漿相對(duì)血清能更準(zhǔn)確地反映機(jī)體循環(huán)DNA的真實(shí)水平，但血液必須在采集后1～4 h內(nèi)離心分離[9]。

腫瘤的表觀遺傳變異類型包括DNA甲基化、基因拷貝數(shù)變化、單堿基突變、基因融合、原癌基因異常表達(dá)等[10]。ctDNA的定性分析即是對(duì)腫瘤特異性基因突變的檢測(cè)。研究表明，在食管癌患者血漿中cfDNA的分布與相應(yīng)腫瘤組織中檢測(cè)到的DNA分布呈高度一致[11]。通過對(duì)ctDNA的監(jiān)測(cè)能夠檢測(cè)到腫瘤患者組織和血漿中存在的特有突變，準(zhǔn)確地對(duì)腫瘤進(jìn)行分型，從而指導(dǎo)臨床治療。

2 ctDNA在食管癌患者中的應(yīng)用

ctDNA的分析應(yīng)用可貫穿于惡性腫瘤的整個(gè)診治過程，如組織病理標(biāo)本獲取困難的腫瘤患者治療策略的制定，治療過程中監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和識(shí)別耐藥性突變的出現(xiàn)等。許多研究已證實(shí)，同時(shí)檢測(cè)的血漿和組織樣本之間關(guān)鍵位點(diǎn)的改變，其一致性高達(dá)80%～90%[12-14]。另有研究表明，食管癌患者攜帶的腫瘤相關(guān)單核苷酸變異、拷貝數(shù)改變及結(jié)構(gòu)變異等遺傳學(xué)改變，為食管癌的診斷、監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷及治療療效、預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后等提供了依據(jù)[15]。

2.1ctDNA在食管癌早期診斷中的應(yīng)用 腫瘤早期發(fā)現(xiàn)是減少腫瘤相關(guān)死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。早期食管癌沒有特異性臨床癥狀，確診時(shí)多處于中晚期。但ctDNA的異常在腫瘤發(fā)生的早期就可檢測(cè)到。食管鱗癌患者血漿ctDNA水平顯著高于健康人群，并且TNM分期為晚期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血漿ctDNA水平顯著高于TNM分期早期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。

DNA甲基化是目前發(fā)現(xiàn)的在食管癌分子診斷中具有廣泛應(yīng)用前景的一種生物學(xué)標(biāo)志物，并且與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物無(wú)相關(guān)性。研究表明，循環(huán)DNA中檢測(cè)到的CASZ1、CDH13和ING2基因高甲基化可作為食管癌診斷的一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[11]。Fece等[16]研究了超過9 000個(gè)CpG位點(diǎn)的cfDNA甲基化評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，cfDNA甲基化評(píng)分用于預(yù)測(cè)癌癥類型的準(zhǔn)確性可以達(dá)76.3%。這提示血漿游離DNA甲基化譜可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于食管癌的診斷。

此外，微衛(wèi)星改變也可以從食管鱗癌患者的血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)。例如Eisenberger等[17]檢測(cè)了食管癌患者的腫瘤及血清中微衛(wèi)星情況，并以健康個(gè)體作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)92.9%的食管鱗癌患者原發(fā)腫瘤中有1個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星DNA改變，96.4%的患者血清中至少有1個(gè)微衛(wèi)星DNA變化，而健康人對(duì)照者血清DNA中均未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星改變，提示血清微衛(wèi)星DNA分析也是檢測(cè)食管鱗癌的1個(gè)具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的指標(biāo)。

2.2ctDNA在食管癌治療中的應(yīng)用 早期食管癌僅需接受單純的手術(shù)或放療，而中晚期食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為同步放、化療。最近一項(xiàng)研究表明，食管腺癌患者ctDNA數(shù)量和突變頻率均隨腫瘤分期增加而增加，并可在臨床或影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展前檢測(cè)到ctDNA水平變化[18]。因此，對(duì)于臨床分期為早期但伴有ctDNA數(shù)量或頻率增加的患者給予更積極的治療或可改善這部分患者的預(yù)后。

晚期轉(zhuǎn)移性食管癌通常接受全身藥物治療。研究顯示，上消化道腫瘤患者的不同轉(zhuǎn)移病灶和原發(fā)腫瘤間的MET基因擴(kuò)增具有顯著的異質(zhì)性[19]。單病灶活檢的分子譜不足以指導(dǎo)靶向治療藥物的選擇。ctDNA來(lái)源于全身腫瘤，能克服腫瘤區(qū)域異質(zhì)性問題，較全面地反映腫瘤基因全貌。

Petty等[20]設(shè)計(jì)了一項(xiàng)多中心前瞻性雙盲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療的EGFR擴(kuò)增食管癌患者與安慰劑組相比其總體生存率顯著提高，但在EGFR陰性食管癌患者中，吉非替尼組與安慰劑組相比總體生存率沒有顯著差異。相關(guān)研究證實(shí)，血漿ctDNA中EGFR的突變狀態(tài)與相應(yīng)的腫瘤組織相一致，提示可以使用血漿ctDNA替代組織來(lái)評(píng)估EGFR突變狀態(tài)，篩選出適合接受吉非替尼治療的患者[21]。

值得關(guān)注的是，食管鱗癌和食管腺癌在發(fā)病機(jī)制上顯著不同，也具有明顯不同的分子特征。食管鱗癌表現(xiàn)出頻繁的CCND1、NOTCH1、SOX2和/或TP63的基因組擴(kuò)增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4和GATA6基因改變則在食管腺癌中更為常見[22-23]。應(yīng)慎重對(duì)待文獻(xiàn)中關(guān)于食管癌藥物治療的相關(guān)結(jié)論。

2.3ctDNA在評(píng)估食管癌患者預(yù)后及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的應(yīng)用 早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于復(fù)發(fā)后早期干預(yù)和延長(zhǎng)患者生存非常重要。目前臨床上采用的血液腫瘤標(biāo)志物的陽(yáng)性率低，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，而ctDNA可以作為腫瘤微小殘留的潛在生物學(xué)標(biāo)志物預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后。ctDNA異常升高意味著患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，晚期實(shí)體腫瘤患者血漿循環(huán)DNA的中位濃度可達(dá)健康志愿者的3倍以上，且濃度越高，總體存活率越低[24]。通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA可以先于影像學(xué)檢查數(shù)周至數(shù)月發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展[25-26]。

通過檢測(cè)ctDNA的腫瘤相關(guān)突變及甲基化也可以預(yù)判食管癌患者的預(yù)后。Ling等[27]采用實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR(real-time MSP)對(duì)209例食管鱗癌患者的腫瘤組織樣本和血漿樣本MSH2基因啟動(dòng)子高甲基化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示209例食管鱗癌患者中有101例組織樣本發(fā)現(xiàn)異常MSH2甲基化，而其中77例的血漿DNA樣本發(fā)生了相同的變化。隨訪數(shù)據(jù)顯示，血漿DNA中MSH2高甲基化的食管鱗癌患者術(shù)后無(wú)病生存期(disease-free survival,DFS)明顯低于MSH2非甲基化患者(RR=21.357,95%CI:8.448～55.279,P=0.000)。Pennathur等[28]通過回顧癌癥基因組圖譜項(xiàng)目數(shù)據(jù)以及食管癌分子分層和分類的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)食管腺癌中的基因表達(dá)譜也與患者預(yù)后顯著相關(guān)。以上研究提示，ctDNA甲基化狀態(tài)無(wú)論對(duì)食管鱗癌還是食管腺癌都是具有臨床應(yīng)用價(jià)值的預(yù)測(cè)因子。

此外，血漿DNA中CCND1基因擴(kuò)增的食管鱗癌患者復(fù)發(fā)頻率明顯升高，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間較短，是判斷復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[29]。食管癌患者ERBB2基因擴(kuò)增與患者存活率之間也存在顯著關(guān)聯(lián)，但僅有約7%的患者可以檢測(cè)到ERBB2擴(kuò)增[30]。聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)基因組異常或可提高血漿DNA預(yù)測(cè)食管癌復(fù)發(fā)的效率。

3 小結(jié)及展望

液體活檢成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。雖然循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)也可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤狀態(tài)，但CTCs有著極高的異質(zhì)性并存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等缺陷，尚未能在臨床上廣泛使用。ctDNA可先于影像學(xué)檢查診斷早期腫瘤，并可在疾病過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，且克服了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，提供更完整的信息。但ctDNA在食管癌的臨床應(yīng)用仍存在諸多挑戰(zhàn)，如ctDNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化、敏感性仍有欠缺，尤其對(duì)ctDNA水平較低者，同一血液樣本采用不同測(cè)序方法的檢測(cè)結(jié)果也存在差異。綜上所述，作為非侵襲性診斷標(biāo)志物，ctDNA在食管癌的早期診斷、治療、預(yù)后評(píng)估以及個(gè)體化治療等方面具有重要作用，隨著分子標(biāo)記研究的不斷深入，ctDNA將為食管癌的診治及預(yù)后改善提供新手段。