胡云軒，楊土保

（中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

人類食品必須具備的條件除本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還不應(yīng)對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用。食品衛(wèi)生檢測(cè)目的是及時(shí)檢測(cè)出食物有害部分，可分為生物性危害、有害化學(xué)物質(zhì)、物理性污染三方面的檢測(cè)，其中歸屬于生物性危害的病原性微生物是食品安全最大危害。傳統(tǒng)病原性微生物檢測(cè)基本通過(guò)物理方法（顯微鏡技術(shù)、染色技術(shù)等）與生化方法（淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等）[1]進(jìn)行，成本要求高、效率低、速度緩慢、部分有害物質(zhì)難以檢測(cè)[2]?；蛱结樇夹g(shù)作為現(xiàn)代社會(huì)食品衛(wèi)生檢測(cè)技術(shù)的一種手段，不僅克服了傳統(tǒng)的食品衛(wèi)生檢測(cè)中的不足，還具有強(qiáng)特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

1 基因探針技術(shù)的食品衛(wèi)生檢測(cè)原理

基因探針技術(shù)又稱DNA探針技術(shù)[3]、分子雜交術(shù)，可用來(lái)檢測(cè)食品中有害微生物。堿基互補(bǔ)配對(duì)條件下的核酸雜交是主要的檢測(cè)原理，經(jīng)過(guò)處理的兩條堿基互補(bǔ)的DNA鏈在合當(dāng)條件下按互補(bǔ)配對(duì)原則，人工形成雜交DNA分子。由于病原性微生物的形態(tài)和特性很大程度由基因決定，每種病原微生物都有獨(dú)特的DNA序列排序，將某種病原微生物進(jìn)行基因標(biāo)記制成標(biāo)記性基因探針（如用32P同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記等），根據(jù)堿基配對(duì)，通過(guò)考察待測(cè)樣本與標(biāo)記性基因探針能否形成雜交分子，就可以判斷樣本中是否含有此種病原性微生物（目前大腸桿菌、李斯特氏菌、葡萄球菌等較為常用[4]）。通過(guò)測(cè)定放射性的強(qiáng)度，還可以間接考察樣品微生物的具體數(shù)量。

2 基因探針技術(shù)的進(jìn)展

自1975年Southern第一次提出基因探針雜交技術(shù)以來(lái)，該技術(shù)成為現(xiàn)代生物學(xué)衛(wèi)生檢測(cè)中的重要技術(shù)手段。目前基因探測(cè)手段分為兩類[5]：一種稱為異相雜交技術(shù)或固相雜交技術(shù)（常見(jiàn)有Southern印跡法、非放射性DNA探針、DNA生物傳感器探針等）；另一種稱同相雜交技術(shù)或液相雜交技術(shù)（常見(jiàn)有雙探針常規(guī)技術(shù)、分子信標(biāo)探針等）。

2.1 異相雜交技術(shù)

異相雜交也被稱之為固相雜交，主要在溶液環(huán)境中進(jìn)行，參與反應(yīng)的DNA一條單鏈以游離的形態(tài)存在于溶液中，另一條單鏈固定于固相支持物（硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等）上，在檢測(cè)過(guò)程中，與底物相結(jié)合的單鏈被固相支持物固著，未與底物結(jié)合的單鏈在溶液中洗脫。一旦反應(yīng)產(chǎn)物固著，則不易洗脫，因而在食品衛(wèi)生檢測(cè)中最為常用。異相雜交技術(shù)的印跡法是最早的基因探針雜交技術(shù)，最早由同位標(biāo)記法記錄。隨著技術(shù)的進(jìn)展，更多食品衛(wèi)生檢測(cè)逐漸采用放射性探針。放射性強(qiáng)度越強(qiáng)，檢出陽(yáng)性率越高，檢測(cè)結(jié)果也就越好。

基因生物傳感器探針技術(shù)是近些年發(fā)展的基于基因探針技術(shù)與生物傳感器技術(shù)的新手段?；蛏飩鞲衅魈结樇夹g(shù)的原理是把基因探針固定在物體的表面，通過(guò)適當(dāng)?shù)膫鞲衅髋c信號(hào)放大裝置，將反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的電、光等物理信號(hào)從而能夠進(jìn)行食品衛(wèi)生檢測(cè)與監(jiān)控[6]。

2.2 同相雜交技術(shù)

同相雜交技術(shù)也被稱為液相雜交，與異相雜交相比不需要固定基因、刪除沒(méi)有雜交基因等操作。同相雜交的兩個(gè)標(biāo)記探針主要在溶液中與目標(biāo)基因雜交，根據(jù)分子量的不同通過(guò)平衡密度梯度離心分離雜交體，從而得出檢測(cè)結(jié)果。但是雜交完成后未互補(bǔ)配對(duì)或操作失敗的成分混雜于液相中，導(dǎo)致最終結(jié)果準(zhǔn)確度與精確度不高[7]。

分子信標(biāo)探針技術(shù)是近年來(lái)的熱門話題，其主要原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，在探針末端進(jìn)行熒光標(biāo)記，只有完全互補(bǔ)的基因才可以與分子信標(biāo)探針進(jìn)行雜交，由此可見(jiàn)分子信標(biāo)探針技術(shù)具有非常高的特異性[8-9]。

2 PCR技術(shù)與探針檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合

PCR技術(shù)又被稱之為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)展運(yùn)用到食品安全與食品衛(wèi)生檢測(cè)的領(lǐng)域當(dāng)中[10]。PCR技術(shù)通過(guò)變性、退火、復(fù)火、延伸四個(gè)步驟可以大量拷貝出食品致病菌的某一特定基因排列順序。該技術(shù)只需要很少量的待檢測(cè)微生物，就能擴(kuò)增出滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)需要的片斷以進(jìn)行定性定量分析，因此，PCR的技術(shù)常常與DNA探針技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用。利用PCR的技術(shù)可以大大提高基因探針技術(shù)在食品衛(wèi)生檢測(cè)中的靈敏度。將其用做食物中少量病原微生物的檢測(cè)技術(shù)手段，大大提高了基因探針技術(shù)在食品衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用。但是PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的精密度與操作人員的業(yè)務(wù)能力有著很高的要求，涉及操作復(fù)雜，技術(shù)含量高，現(xiàn)階段無(wú)法大范圍普及。

3 基因探針技術(shù)在食品衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 基因探針的構(gòu)建

近年來(lái)基因探針技術(shù)在食品衛(wèi)生檢測(cè)中起了重要作用[11]，目前基因探針技術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)食物中含有的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶希氏菌、李斯特菌等。基因探針構(gòu)建的成功與否很大程度決定實(shí)驗(yàn)是否失敗。在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中，微生物種屬所特有的基因序列（也被稱為特異性保守序列）是探針構(gòu)建的關(guān)鍵，該基因序列的保守性有利于提升檢測(cè)的精確性。

3.2 基因探針的優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法一般涉及對(duì)病原微生物的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)以及理化特性的分析，在多年實(shí)際運(yùn)用中已經(jīng)證明其具有一定的有效性與特異性，但病原微生物的生存條件、生長(zhǎng)速度、檢測(cè)方法固有缺陷使其運(yùn)用范圍局限。由于需要對(duì)病原微生物的人工培養(yǎng)，所以傳統(tǒng)檢測(cè)方法局限于已知種類的微生物，對(duì)未知病原微生物的培養(yǎng)具有著盲目性?；蛱结樇夹g(shù)與之相比，不僅僅能克服以上所述傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法的不足，還可與PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)、免疫酶聯(lián)技術(shù)等多種新技術(shù)等相結(jié)合，大幅度提升了檢測(cè)的靈敏性、特異性，運(yùn)用范圍也大幅度地拓寬。

3.3 注意事項(xiàng)

為了確保食品衛(wèi)生檢測(cè)的準(zhǔn)確度，一定要根據(jù)確定具體的檢測(cè)目標(biāo)，制造不同基因探針。建立檢測(cè)食品衛(wèi)生中微生物基因探針的基礎(chǔ)原則用來(lái)檢查微生物的排列標(biāo)準(zhǔn)和順序，并以特異性的保守基因排序作為基因目標(biāo)，把這種排序的互補(bǔ)基因作為雜交探針技術(shù)。對(duì)于一些微生物來(lái)說(shuō)，可以把微生物特有的生理基因變化來(lái)決定獨(dú)特排列的基因探針技術(shù)。例如和其他的微生物比較，大腸桿菌具有葡糖苷酸酶的特異性，可用來(lái)檢測(cè)食品中含有的總大腸桿菌數(shù)量，從而檢測(cè)食品衛(wèi)生情況。

3.4 基因探針技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用成果

①美國(guó)Gene-Trak公司開(kāi)發(fā)出檢測(cè)食品中大腸桿菌的商品級(jí)基因探針系統(tǒng)，先聯(lián)合PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，達(dá)到檢測(cè)數(shù)量級(jí)后即可基因探針檢測(cè)，該系統(tǒng)無(wú)需傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可快速精準(zhǔn)完成檢測(cè)。②Moseley利用生物標(biāo)記克隆沙門氏菌DNA片段作為基因探針，檢測(cè)飲用水、食物、飼料中的沙門菌屬。③對(duì)于不同種類大腸桿菌，如ETEC、EHEC、EPEC等，最新研究通過(guò)其特有的產(chǎn)毒基因序列、腸出血基因序列、致腸病基因序列的基因探針的精細(xì)構(gòu)建，可用于鑒別。

3.5 存在的問(wèn)題

①在基因探針的構(gòu)建方面：若用同位素進(jìn)行標(biāo)記，需考慮同位素的半衰期以及放射性核素對(duì)人體的影響，尤其是食品領(lǐng)域，更需要進(jìn)一步完善；若用生物素標(biāo)記，在紫外線下容易分解，尤其食品領(lǐng)域中內(nèi)源性生物素化蛋白和糖蛋白常引起背景加深與一系列非特異反應(yīng)。②在基因探針的特異性方面，該技術(shù)更適用于已知序列的病原微生物，若病原微生物未知，檢測(cè)有很強(qiáng)盲目性。③在實(shí)際運(yùn)用中，菌落雜交的敏感性也受菌落雜交的影響，同時(shí)對(duì)技術(shù)人員、實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，廣泛運(yùn)用受限，需要更加精細(xì)的技術(shù)支持。

現(xiàn)階段傳統(tǒng)方法仍在食品衛(wèi)生檢測(cè)中最常用，存在著成本較高、浪費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題。有些微生物不能人工進(jìn)行培養(yǎng)或者培養(yǎng)條件苛刻、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的特性使利用微生物傳統(tǒng)檢測(cè)方法在食品衛(wèi)生檢測(cè)中困難重重，越來(lái)越多的問(wèn)題急需解決。例如使用葡糖苷酸酶鑒別檢測(cè)大腸桿菌是現(xiàn)在日本和美國(guó)常用的檢測(cè)食物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的方法，但多次檢測(cè)已發(fā)現(xiàn)幾種因基因突變而產(chǎn)生的假陰性衛(wèi)生檢測(cè)結(jié)果。社會(huì)發(fā)展對(duì)食品衛(wèi)生檢測(cè)提出了強(qiáng)特異性、高靈敏度和操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間等方面的要求?；蛱结樇夹g(shù)在食品衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。