付寶軍 姜靜靜 黃玉瓊 林宗航 李 恒

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院麻醉科，清遠(yuǎn) 511518）

瑞芬太尼作為一種強(qiáng)效的受體激動(dòng)劑，由于其半衰期短，停藥后迅速恢復(fù)，因此，廣泛應(yīng)用于全身麻醉病人術(shù)中鎮(zhèn)痛維持。然而，大量的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼在發(fā)揮其強(qiáng)大鎮(zhèn)痛作用同時(shí)常常誘發(fā)痛覺過敏 (remifentanil-induced hyperalgesia, RIH)，表現(xiàn)為病人在瑞芬太尼給藥后對(duì)疼痛刺激超敏現(xiàn)象[1]，痛覺過敏是術(shù)中使用瑞芬太尼后面臨的十分棘手的問題，給術(shù)后疼痛管理帶來了更大的挑戰(zhàn)。迄今為止，痛覺過敏的具體機(jī)制尚未闡明[2]，現(xiàn)有的防治痛覺過敏藥物有其自身局限性。膠質(zhì)細(xì)胞尤其小膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺過敏中作用已經(jīng)證實(shí)[3,4]，但是在痛覺過敏中，小膠質(zhì)細(xì)胞活化調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚；Peli 是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的E3 泛素連接酶家族，包括Peli1、Peli2 和Peli3[5]，Peli1 作為一種小膠質(zhì)細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子參與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎[6]、蛛網(wǎng)膜下腔出血[7]和西尼羅河病毒腦炎的病理生理過程[8]。更重要的是，Peli1 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與坐骨神經(jīng)壓迫致痛覺過敏[9]以及嗎啡鎮(zhèn)痛耐受導(dǎo)致痛覺過敏[10]。然而Peli 是否通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺過敏尚不清楚。本研究通過觀察痛覺過敏大鼠脊髓Peli1 表達(dá)變化以及預(yù)先鞘內(nèi)注射特異Peli1shRNA 對(duì)痛覺過敏大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及痛行為學(xué)影響，首次探討Peli1 在痛覺過敏中作用及其可能機(jī)制, 為痛覺過敏發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)防治痛覺過敏藥物提供新的作用靶點(diǎn)。

方 法

1.主要試劑及儀器

注射用瑞芬太尼購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任；PCR 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司；von Frey 細(xì)絲、熱痛刺激儀購(gòu)自Stoelting 公司；兔抗大鼠Peli1 單克隆抗體、兔抗大鼠Iba1 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司；Trizol RNA 抽提試劑、BeyoR TTM cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、焦碳酸二乙酯購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司；PCR 引物購(gòu)自天跟生化科技北京有限公司。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～230 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于12 h 光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。室溫(22.0±0.5)℃，濕度55%±10%。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理要求并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則進(jìn)行。36 只大鼠隨機(jī)分成6 組：生理鹽水對(duì)照組（S 組），瑞芬太尼組（R 組），生理鹽水+鞘內(nèi)注射scrambled shRNA組（S + shscr組），生理鹽水+鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 組（S + shPeli1 組），瑞芬太尼+鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 組（R + shscr組），瑞芬太尼+鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 組（R + shPeli1 組），每組6 只。S 組：經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R 組：經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h；S + shscr 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 10 μl 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R + shscr 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射scrambled shRNA10 μl (1×109TU) 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h；S + shPeli1 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 5 μg/10 μl (2×108TU) 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R + shPeli1 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 5 μg/10 μl 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h。

3. 方法

（1）shRNA 寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)合成：根據(jù)Peli1 miRNA 序列設(shè)計(jì)shRNA 1、2、3 和陰性對(duì)照 (scrambled shRNA)，每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA，正、反義鏈的5'端分別引入GATCC 和AATTC，分別與BamH I 和EcoR I 酶切后的粘性末端互補(bǔ)，經(jīng)Blast 比對(duì)與人類其他基因編碼序列無(wú)同源性，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

（2）Peli1 shRNA 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建：使用BamH I和EcoR I 對(duì)慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將shRNA 寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA 并與雙酶切后的質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α 大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆后委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。Peli1 (shRNA1: 5'-GGATTTATGCTGCAGGGTTTG-3'; shRNA2: 5'-GGTGGTTGAAT ATACTCATGA-3'; shRNA3: 5'GGTTCACAGAAGACTCCAAAC-3') 和含scrambled shRNA 慢病毒 (shscr: 5'-TTC TCCGAACGTGTCACGT-3')。

（3）建立瑞芬太尼痛覺過敏模型：參照文獻(xiàn)[11]大鼠七氟烷（新晨藥業(yè)，中國(guó)）吸入麻醉后，尾靜脈穿刺置入24 G 靜脈留置針，連接電子注射泵（廣西威力方舟科技有限公司，中國(guó)），根據(jù)分組持續(xù)泵注瑞芬太尼（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，中國(guó)）4 μg/(kg·min) 2 h，生理鹽水組以相同速率泵注等體積生理鹽水。術(shù)中大鼠面罩給氧，維持自主呼吸。

（4）鞘內(nèi)注射：S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠吸入七氟烷麻醉后，參照Mestre 等[12]描述的方法將大鼠俯臥，定位脊柱L4-L5間隙，備皮，消毒，以微量注射器從椎間隙垂直緩慢進(jìn)針，尾巴突然出現(xiàn)顫動(dòng)或甩動(dòng)，標(biāo)志成功穿入鞘內(nèi)，此時(shí)保持穿刺針位置不變并緩慢注入scrambled shRNA 或Peli1shRNA，其劑量參照文獻(xiàn)[9]。

（5）機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)測(cè)定：用von Frey 纖維絲按照updown 法推算MWT：將一有機(jī)玻璃箱 (22 cm×22 cm×22 cm) 置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min 后，采用IITC2390 系列電子von Frey 垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤ 4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，每次刺激間隔10 s，重復(fù)5 次。

（6）熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 測(cè)定：按文獻(xiàn)方法測(cè)定大鼠足底的TWL，即將大鼠置于底為光滑玻璃的有機(jī)玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)20 min 待大鼠安靜后，從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間，以此表示熱痛閾。單次光照射時(shí)間不超過30 s，同一部位刺激的間隔時(shí)間為5 min，連續(xù)測(cè)定3 次，取平均值。

（7）Western blotting：利用BCA 蛋白測(cè)試盒測(cè)出總蛋白。按照35 μg、15 μl 每孔上樣，10%聚丙烯凝膠電泳濃縮膠40 V，分離膠100 V 分離，切膠后將相應(yīng)分子量條帶上目的蛋白和內(nèi)參照蛋白在300 mA 條件下轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入Peli1 抗體、Iba1 抗體、 GFAP抗體 (1:1000 )和β-actin 抗體 (1:1000) 中，4℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST 洗膜3 次，每次5 min，二抗(1:5000) 室溫孵育2 h 后用TBST 洗膜（同前）、ECL 曝光，采用Quantity One Software 進(jìn)行分析，以目的蛋白/β-actin 的灰度比值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

（8）PCR (RT-qPCR)：檢測(cè)行為學(xué)后，斷頸處死大鼠，分離腰椎，獲取脊髓。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)Peli1mRNA 的表達(dá)。反應(yīng)體系為25 μl 體系，包括2 μl cDNA 模板、上下游定量引物各0.5 μl、12.5 μl 反應(yīng)緩沖液和9.5 μl 超純水。反應(yīng)為：95℃預(yù)變1 min，然后以94℃變15 s、60℃退火延伸60 s的條件擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)，RT-qPCR 儀 (Bio-Rad) 檢測(cè)并分析。引物序列如下：Peli1: TGCTAAGTGCTCTAGCCGAG/CCCCCAACAGTCAGCAAGAC; Iba1: ATGACCAAAGCA GG GAT/CTTCAAGTTTGGACGGCA G; GFAP: GGTGTCCAGGCTGGTTTCTC/CAAGCCAGACCTCACAGCG; β-actin: CCACACCCGCCACCAGTTCG/TACAGCCCGG GGAGCATCGT。

（9）ELISA：大鼠深麻醉后在冰上迅速取出L4-5脊髓節(jié)段，按每g 凈重組織與9 ml 預(yù)冷的生理鹽水稀釋比例。勻漿后于4℃, 4000 rpm 下離心15 min（離心半徑5 cm），提取上清液并在-80℃保存。按ELISA 試劑盒公司提供的方法檢測(cè)蛋白并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)3 次計(jì)算出各組上清液TNF-α、IL-6和IL-1β 濃度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。MWT 和TWL 比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用Sidak 法；Western Blot、RT-PCR、ELISA 數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 法；P < 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 靜脈輸注瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏

通過分別測(cè)量大鼠MWT 和TWL 評(píng)價(jià)機(jī)械痛敏和熱痛敏，各組基礎(chǔ)MWT 和TWL 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與S 組相比，R 組大鼠在給瑞芬太尼后6 h、1 天、3 天MWT 和TWL 明顯降低(P < 0.001)，表明痛覺過敏模型成功建立， MWT 和TWL 于第5天恢復(fù)至對(duì)照水平（見圖1）。

圖1 靜脈輸注瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏 (n = 6, ±SD)(A) MWT 時(shí)程變化；(B) TWL 時(shí)程變化 ***P < 0.001, 與S 組相比Fig. 1 Intravenous infusion of remifentanil induc mechanical allodynia and heat hyperalgesia in rats (n = 6, ±SD)(A) The time course of MWT; (B) The time course of TWL. ***P < 0.001, compared with group S.

2. 靜脈輸注瑞芬太尼導(dǎo)致大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達(dá)增加

進(jìn)一步探究靜脈輸注瑞芬太尼對(duì)大鼠脊髓Peli1表達(dá)水平的影響。對(duì)各組Peli1 蛋白印跡相對(duì)灰度值以及mRNA 相對(duì)表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果顯示，與S 組相比，瑞芬太尼輸注后6 h 大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)(P < 0.001)，1 天上調(diào)最為明顯(P < 0.001)，5 天基本恢復(fù)至對(duì)照水平（見圖2）。

圖2 靜脈輸注瑞芬太尼增加大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 的表達(dá)(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角Peli1 蛋白表達(dá)及定量分析；(B) 大鼠脊髓背角Peli1mRNA 定量分析***P < 0.001, 與Baseline 相比Fig. 2 Remifentanil infusion increases the protein and mRNA expression of Peli1 in the spinal cord of rats (n = 3, ±SD)(A) The expression and quantitative analysis of Peli1 protein in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of Peli1 mRNA in the spinal dorsal horn. ***P < 0.001, compared with Baseline.

3. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 減輕瑞芬太尼誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏

為了進(jìn)一步證實(shí)脊髓Peli1 在瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏中作用，于瑞芬太尼輸注前預(yù)先鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 或Peli1shRNA 在基因水平阻斷Peli1 作用。鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 或Peli1sh-RNA 不影響靜脈注射生理鹽水大鼠的基礎(chǔ)MWT 和TWL，而與R + shscr 組相比，R + shPeli1 組大鼠TWL和MWT在6 h、1天、3天明顯增加（P < 0.05，P < 0.001，見圖3）。

圖3 Peli1shRNA 處理減輕瑞芬太尼誘導(dǎo)的大鼠痛覺過敏(n = 6, ±SD)(A) MWT 時(shí)程變化；(B) TWL 時(shí)程變化 *P < 0.05, ***P < 0.001,與R + shscr 組相比Fig. 3 Pretreatment of Peli1shRNA attenuates hyperalgesia induced by remifentanil in rats (n = 6, ±SD)(A) The time course of MWT; (B) The time course of TWL. *P < 0.05, ***P < 0.001, compared with group R + shscr.

4. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 蛋白表達(dá)

瑞芬太尼輸注后第1 天，采用Western blotting分別對(duì)S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 和星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP 蛋白灰度(relative density, RD)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示與S + shscr組比較，R + shscr 組大鼠脊髓Iba1 蛋白灰度增強(qiáng)(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注激活大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞, 與R + shscr 組比較，R + shPeli1 組大鼠脊髓Iba1 蛋白灰度降低(P < 0.001)；各組大鼠脊髓GFAP 蛋白灰度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖4）。

5. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 mRNA 表達(dá)上調(diào)

瑞芬太尼輸注后第1 天，采用RT-PCR 分別對(duì)S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 mRNA 和星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP mRNA 進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果顯示, 與S + shscr 組比較，R + shscr 組大鼠脊髓Iba1 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注激活大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。與R + shscr 組比較，R + shPeli1 組大鼠脊髓Iba1 mRNA 表達(dá)降低(P < 0.001)，提示Peli1shRNA 預(yù)處理能顯著抑制瑞芬太尼所致的Iba1 mRNA 表達(dá)增加。各組大鼠脊髓GFAP mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖5）。

圖5 Peli1shRNA 預(yù)處理抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 mRNA 表達(dá)上調(diào)(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角Iba1 mRNA 定量分析；(B) 大鼠脊髓背角GFAP mRNA 定量分析***P < 0.001,與S + shscr 組相比；###P < 0.001,與R + shscr 組相比Fig. 5 Pretreatment of Peli1shRNA prevents the upregulation of microglia marker Iba1 mRNA induced by remifentanil in the spinal dorsal horn (n = 3, ±SD)(A) Quantitative analysis of Iba1 mRNA in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of GFAP mRNA in the spinal dorsal horn.***P < 0.001, compared with group S + shscr; ###P < 0.001, compared with group R + shscr.

6. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)

瑞芬太尼輸注后第1 天，對(duì)S + shscr 組、S + shPeli1組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示與S + shscr 組相比，R + shscr 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)。與R + shscr 組相比，R + shPeli1 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)明顯降低（P < 0.001，見圖6）。

圖6 Peli1shRNA 預(yù)處理抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)脊髓背角TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角TNF-α 表達(dá)定量分析；(B) 大鼠脊髓背角IL-6 表達(dá)定量分析；(C) 大鼠脊髓背角IL-1β 表達(dá)定量分析***P < 0.001, 與S + shscr 組相比；#P < 0.05, ##P < 0.01,與R + shscr 組相比Fig. 6 Pretreatment of Peli1shRNA prevents the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β induced by remifentanil in the spinal dorsal horn (n = 3, ±SD)(A) Quantitative analysis of TNF-α expression in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of IL-6 expression in the spinal dorsal horn; (C) Quantitative analysis of IL-1β expression in the spinal dorsal horn.***P < 0.001, compared with group S + shscr; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group R + shscr.

討 論

瑞芬太尼作為一種人工合成強(qiáng)效μ 阿片受體激動(dòng)劑，因其起效快，作用時(shí)間短，長(zhǎng)期輸注無(wú)蓄積等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于臨床全身麻醉鎮(zhèn)痛維持。但是近年來發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼較其他阿片類藥物更易誘發(fā)痛覺過敏[13,14]，表現(xiàn)為痛閾下降、痛覺異常敏感甚至出現(xiàn)觸誘發(fā)痛[15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示瑞芬太尼輸注可以誘導(dǎo)大鼠脊髓Peli1 表達(dá)增加，而且預(yù)先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 不僅可以明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，且能夠緩解瑞芬太尼誘導(dǎo)的機(jī)械敏痛和熱痛覺敏感。提示Peli1 介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏。

1.脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏

瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏分子生物學(xué)機(jī)制復(fù)雜，目前已知瑞芬太尼可以通過μ 阿片受體的變異、長(zhǎng)時(shí) 程 增 強(qiáng) (long-term potentiation, LTP)、NMDA 受體的激活和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化等介導(dǎo)痛覺過敏，且可能涉及離子通道、信號(hào)通路、細(xì)胞因子等多方面[16]。然而脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化介導(dǎo)瑞芬太尼痛覺過敏機(jī)制研究一直備受關(guān)注，研究證實(shí)在瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏大鼠模型中，脊髓活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞和N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受體活化介導(dǎo)瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏[4]。另外，研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先鞘內(nèi)注射CCL2 中和抗體可明顯抑制痛敏大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，提示CCL2 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)瑞芬太尼痛覺過敏的過程，且在痛覺過敏中CCL2 可能是神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的媒介[5]。與上述結(jié)果相一致，本研究結(jié)果表明，瑞芬太尼持續(xù)輸注后1 天大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，且此時(shí)大鼠痛敏行為學(xué)表現(xiàn)也最為明顯，以上提示，小膠質(zhì)細(xì)胞激活在瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但對(duì)瑞芬太尼導(dǎo)致痛覺過敏中小膠質(zhì)細(xì)胞激活調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。

2.脊髓Peli1 激活小膠質(zhì)細(xì)胞在瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏中作用

Peli 分子形成了一個(gè)保守的E3 泛素連接酶家族[17]。在不同的Peli 中，Peli1 尤其令人感興趣，因?yàn)榕c其他家族成員相比，Peli1 在LPS 刺激下在小膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)[18]。最近的研究表明，脊髓Peli1 在神經(jīng)損傷和嗎啡鎮(zhèn)痛耐受導(dǎo)致痛覺過敏中發(fā)揮了重要作用[9,10]。本研究結(jié)果顯示，靜脈輸注瑞芬太尼導(dǎo)致大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達(dá)6 h上調(diào)，1 天最為明顯，且變化趨勢(shì)與大鼠痛覺行為學(xué)時(shí)程變化相吻合，提示Peli1 可能參與瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Peli1 在瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏中的作用，采用RNA 干擾技術(shù)探討Peli1shRNA 對(duì)痛覺行為學(xué)影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 明顯抑制Peli1 蛋白及mRNA 表達(dá)，證實(shí)RNA 干擾技術(shù)對(duì)Peli1 抑制有效性，另外，預(yù)先靶向抑制Peli1 明顯抑制瑞芬太尼導(dǎo)致的痛覺過敏；進(jìn)一步提示脊髓Peli1 在瑞芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏中發(fā)揮必要作用。為了進(jìn)一步探討脊髓Peli1 介導(dǎo)痛覺過敏機(jī)制，本研究觀察鞘內(nèi)注射Peli1shRNA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志表達(dá)的影響，結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 可明顯抑制痛敏大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1 表達(dá)，但星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP 表達(dá)未受影響，提示Peli1 可能通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)瑞芬太尼痛覺過敏的過程。一般認(rèn)為，膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥在疼痛中樞敏化中發(fā)揮作用[19,20]，活化膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6 和IL-1β，其與感覺神經(jīng)元表面受體結(jié)合，增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)痛覺過敏[21,22]，因此，我們推測(cè)痛覺過敏形成過程中，Peli1 介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，活化小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放炎性因子，進(jìn)而敏化脊髓神經(jīng)元。本研究表明，瑞芬太尼持續(xù)輸注誘發(fā)大鼠痛覺過敏同時(shí)伴有脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)增加，而預(yù)先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 可明顯抑制痛覺過敏大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)。然而，在瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏中Peli1 可能的細(xì)胞定位即Peli1 原發(fā)生成部位還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

3.脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞Peli1 參與瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏可能的信號(hào)通路

最近的研究顯示，在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，脊髓Peli1 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)其產(chǎn)生和釋放促炎因子如腫瘤壞死因子 (TNF-α)[10]，而后者已被證實(shí)在瑞芬太尼引起痛敏中發(fā)揮著重要作用[23]；此外，脊髓Peli1通過絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受相關(guān)痛覺過敏[10,24]并且脊髓背角p38MAPK 激活有助于瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠術(shù)后痛敏；在腫瘤壞死因子存在的情況下，si Peli1轉(zhuǎn)染細(xì)胞NF-κB RELA轉(zhuǎn)錄活性降低[25]。因此，我們推測(cè)脊髓Peli1 可能通過激活p38MAPK和NF-κB 信號(hào)通路誘發(fā)促炎因子參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏。另外，研究表明，在LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞中，miR590-5p 過表達(dá)靶向抑制Peli1 基因表達(dá)[26]，那么在脊髓水平，miR590-5p 是否靶向調(diào)控Peli1 蛋白參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏，還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明脊髓Peli1 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏，本研究的結(jié)果為痛覺過敏的發(fā)生機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)防治痛覺過敏藥物提供了新的作用靶點(diǎn)。